王振宇,張寧,趙鑫*

(1.東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院,哈爾濱 150040;2.哈爾濱工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,哈爾濱 150086)

黑木耳(Auricularia auricular)營(yíng)養(yǎng)豐富,食味鮮美,不但是營(yíng)養(yǎng)價(jià)值很高的實(shí)用菌,同時(shí)也是具有藥用價(jià)值很高的藥用菌。我國(guó)黑木耳資源豐富,為開(kāi)發(fā)利用黑木耳提供有利的資源條件。黑木耳子實(shí)體具有益氣強(qiáng)身、補(bǔ)血養(yǎng)氣、潤(rùn)肺止血、通便秘等功效,臨床治療高血壓、血管硬化等。藥理和植物化學(xué)成分分析表明,黑木耳中主要活性成分是多糖類化合物。黑木耳多糖具有抗疲勞增強(qiáng)免疫力等作用[1-2]。近年來(lái)食用菌多糖的開(kāi)發(fā)逐漸引起人們的重視,食用菌多糖具有很強(qiáng)的抗氧化能力例如灰樹(shù)花多糖[3]。但是至今沒(méi)有研究黑木耳多糖的抗氧化性。本文采用緩沖溶液提取酸溶性黑木耳多糖并用不同濃度乙醇分級(jí),測(cè)其抗相氧化能力為黑木耳在食品與生物醫(yī)藥開(kāi)發(fā)方面奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

野生黑木耳:產(chǎn)自于大興安嶺,烘干保存。

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH·)、ABTS均為Sigma試劑公司;其余均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

DK-98-11A型電熱恒溫水浴鍋,天津市泰斯特儀器有限公司;FA2004電子分析天平,上海天平儀器廠;PHS-3C精密pH計(jì),上海雷磁廠;T6新世紀(jì)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì),北京普析儀器公司;ALPHAL-2真空冷凍干燥機(jī),Germany;R-205B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,上海申勝儀器公司。

1.3 方法

1.3.1 酸溶性黑木耳分級(jí)多糖的提取

將黑木耳粉末以一定的磷酸鹽緩沖溶液(pH=6)比浸泡。水浴 85℃下浸提 4h,以 4500r/min離心10min。濾渣分別進(jìn)行第二次浸提,離心并與濾液合并,上清液減壓濃縮至原體積的1/3。在磷酸鹽溶液浸提的濃縮液中,分別加乙醇調(diào)醇濃度為50%進(jìn)行醇沉淀(APG6-1),收集沉淀;乙醇調(diào)醇濃度為75%進(jìn)行醇沉淀(APG6-2),收集沉淀;乙醇調(diào)醇濃度為100%進(jìn)行醇沉淀(APG6-3),收集沉淀。沉淀依次用無(wú)水乙醇、丙酮、乙醚洗滌。將黑木耳多糖savage[4]法脫蛋白,重復(fù)4次,醇沉,離心,沉淀依次用無(wú)水乙醇丙酮、乙醚洗滌。自來(lái)水透析48h,蒸餾水透析24h,濃縮后真空冷凍干燥得到酸溶性黑木耳分級(jí)多糖。

1.3.2 ABTS+·清除能力測(cè)定

參考WAN[5]方法,并作適當(dāng)修改。用甲醇配置2.6 mmol/L過(guò)硫酸鉀,用過(guò)硫酸鉀溶解ABTS,配成7.4 mmol/L ABTS+·儲(chǔ)備液。在室溫及避光條件下,靜置過(guò)夜。配制ABTS+·測(cè)定液:吸取1 mL儲(chǔ)備液用甲醇稀釋54.7倍,在744nm波長(zhǎng)吸光度為0.700±0.020(吸光值為0.710)。測(cè)定:取2850 μ L ABTS+·測(cè)定液,加入150μ L樣品待測(cè)液,混合液在黑暗的室溫下放放置2 h,在744nm波長(zhǎng)處測(cè)定溶液混合物的吸光度

1.3.3 DPPH·清除能力的測(cè)定

參考Shimada[6]和林戀竹[7]的方法,并作適當(dāng)修改。取2 mL各濃度的樣品溶液并加入0.2 mmol/L DPPH·乙醇溶液2 mL,混合均勻并放置在避光條件下保存30 min。在517 nm測(cè)得各濃度的樣品溶液吸光度

1.3.4 超氧自由基清除能力的測(cè)定

參考Biao[8]的方法,并作適當(dāng)修改。用10 mmol/L的HCl溶液配置 10 mmol/L鄰苯三酚,并和50 mmol/L Tris-HCI緩沖液 pH8.2的在25℃的恒溫水浴鍋中水浴保溫10 min。分別加入的 Tris-HCI緩沖溶液2.3 mL,待測(cè)樣品液0.5 mL。當(dāng)加入10 mmol/L的鄰苯三酚20μ L,迅速混合均勻反應(yīng)1 min時(shí)開(kāi)始測(cè)定于320 nm處測(cè)定吸光度,每隔30 s記錄吸光值,至反應(yīng)6 min。

1.3.5 金屬鰲合力的測(cè)定

參考Dinis[9]的方法,并作適當(dāng)修改。分別加入待測(cè)樣品液1 mL,3.7 mL甲醇和2 mmol/L的氯化亞鐵0.1mL溶液放置10min。最后加入5 mmol/L ferrozine試劑0.2 mL。冷卻至室溫10 min,在562 nm處波長(zhǎng)下測(cè)吸光值。吸光值越低表明螯合能力越強(qiáng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 酸溶性黑木耳分級(jí)多糖對(duì)ABTS+·的清除作用

圖1 酸溶性黑木耳分級(jí)多糖對(duì)ABTS+·的清除能力

如圖1所示,三種酸溶性黑木耳多糖對(duì)ABTS+·自由基都有很顯著的清除作用。而且在0.1～10 mg/mL濃度范圍內(nèi),APG6-1 APG6-2和APG6-3的濃度與清除率呈量效關(guān)系,且在濃度為20 mg/mL時(shí)清除率達(dá)到最高,APG6-1為 84.9%,APG6-2為88.2%,APG6-3為 98.4%,而陽(yáng)性對(duì)照VC、BHA、VE的清除率分別為98.3%、99.4%、97.2%。表明APG6-3的抗氧化活性高于VE,與VC相持平,比BHA略低,且明顯好于APG6-1和APG6-2。

2.2 酸溶性黑木耳分級(jí)多糖對(duì)DPPH的清除作用

如圖2所示,3種酸溶性黑木耳多糖對(duì)DPPH自由基都具有顯著的清除作用,且在0.1～20mg/mL濃度范圍內(nèi),APG6-1 APG6-2和APG6-3都隨著樣品濃度的增加,對(duì)DPPH自由基清除率也逐漸增加。以陽(yáng)性對(duì)照 VC、BHA、VE,在 20 mg/mL時(shí)清除率分別為89.9%、96.9%、99.3%。APG6-3和 APG6-2在 20 mg/mL時(shí)對(duì) DPPH自由基清除率達(dá)到90.3%和86.7%,雖然不及BHA、VE,但是與VC相持平。而APG6-1清除DPPH自由基為73.5%。

圖2 酸溶性黑木耳分級(jí)多糖對(duì)DPPH的清除作用

2.3 酸溶性黑木耳分級(jí)多糖對(duì)超氧自由基的清除作用

圖3 酸溶性黑木耳分級(jí)多糖超氧陰離子的清除作用

超氧陰離子自由基具有很高的毒性,它可以經(jīng)過(guò)一系列反應(yīng)生成其它氧自由基。如圖3所示,陽(yáng)性對(duì)照VC在濃度在2mg/mL時(shí)清除率最高,為 95.5%。在濃度為0.1～2 mg/mL時(shí),APG6-3清除率最高,對(duì)超氧陰離子清除率由31.8%增到74.9%,與VC相對(duì)低些。而APG6-2和APG6-1的清除超氧陰離子能力只有61.3%和57.1%

2.4 酸溶性黑木耳分級(jí)多糖對(duì)金屬離子螯合力

圖4 酸溶性黑木耳分級(jí)多糖對(duì)金屬離子螯合力

研究表明,金屬離子與體內(nèi)氧化反應(yīng)有關(guān),螯合金屬離子是有效的清除OH自由基的方法。如圖4所示,陽(yáng)性對(duì)照檸檬酸、EDTA,在10mg/mL時(shí)螯合力為15.3%、97.3%,檸檬酸不是金屬離子螯合的很好的陽(yáng)性對(duì)照劑。在0.1～5mg/mL濃度范圍內(nèi),APG6-1 APG6-2和APG6-3多糖的濃度與螯合力呈量效關(guān)系。5～10mg/mL濃度范圍內(nèi),三種多糖對(duì)金屬離子螯合力趨于平緩。明顯APG6-3和APG6-2在10mg/mL時(shí)對(duì)金屬離子螯合力已經(jīng)達(dá)到86.3%和82.1%,APG6-1只有78.9%。

3 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)酸溶性黑木耳多糖都表現(xiàn)出很強(qiáng)的抗氧化能力,但是不同提取工藝下的多糖,在不同抗氧化體系中,其抗氧化活性差異顯著。其中,APG6-3具有較強(qiáng)的清除DPPH、ABTS、超氧陰離子和金屬離子螯合能力。在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi),最大作用效應(yīng)分別為98.4%、99.3%、74.9%和86.3%。為進(jìn)一步研究黑木耳多糖其生物活性奠定基礎(chǔ)。

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