郝吉福，李菲，王建筑，郭豐廣，孔志峰，彭新生

(1.山東泰山醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，山東泰安271016;2.廣東醫(yī)學(xué)院，廣東東莞523008)

處方設(shè)計(jì)是藥劑學(xué)的重要研究?jī)?nèi)容之一，在工藝優(yōu)化和處方篩選過(guò)程中，常需要同時(shí)考察不同因素、不同水平對(duì)結(jié)果的影響，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行優(yōu)化。而優(yōu)化設(shè)計(jì)的目的是進(jìn)行相互制約特性的有效協(xié)調(diào)，既能獲得最佳處方設(shè)計(jì)要求又能在一定的限制條件下制成制劑。從數(shù)學(xué)和工程設(shè)計(jì)角度，處方設(shè)計(jì)可以概括為一個(gè)復(fù)雜的多因素、多水平、多目標(biāo)同時(shí)優(yōu)化問(wèn)題［1］。目前國(guó)內(nèi)應(yīng)用較多的統(tǒng)計(jì)學(xué)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法主要有正交設(shè)計(jì)和均勻設(shè)計(jì)［2］，國(guó)外近年來(lái)常用集數(shù)學(xué)和統(tǒng)計(jì)學(xué)方法于一體的效應(yīng)面優(yōu)化法response surface methodology，RSM進(jìn)行優(yōu)化［3］。

效應(yīng)面優(yōu)化法［4］是采用多元二次回歸方程來(lái)擬合因素和響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，通過(guò)對(duì)回歸方程的分析來(lái)尋求最優(yōu)工藝參數(shù)，解決多變量問(wèn)題的一種統(tǒng)計(jì)方法。具體過(guò)程包括實(shí)驗(yàn)、建模、數(shù)據(jù)分析和最優(yōu)化。RSM常用的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法有星點(diǎn)設(shè)計(jì)(central composite design，CCD)、Box-Behnken設(shè)計(jì)(BBD)和Doehlert設(shè)計(jì)(DM)。

為了客觀地對(duì)比正交實(shí)驗(yàn)和BBD實(shí)驗(yàn)優(yōu)化方法的優(yōu)勢(shì)和差異，本文在優(yōu)化制備薄荷油-β-環(huán)糊精包合物過(guò)程中，應(yīng)用上述兩種統(tǒng)計(jì)學(xué)優(yōu)化方法，控制相同的考察范圍(因素、水平)并對(duì)優(yōu)化結(jié)果進(jìn)行了比較，以探討藥劑學(xué)研究中對(duì)不同優(yōu)化方法進(jìn)行合理選擇。

1 儀器與材料

揮發(fā)油測(cè)定儀(上海玻璃儀器廠);SHZ-E型循環(huán)水式真空泵(河南鞏義英峪儀器有限責(zé)任公司);HJ-2電動(dòng)攪拌器(江蘇金壇市金城國(guó)勝實(shí)驗(yàn)儀器廠);F1004電子分析天平(上海天平廠);薄荷油(安徽太和縣藥用薄荷總廠，批號(hào):20090322);β-環(huán)糊精(安徽山河藥用輔料有限公司);其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄荷油-β-環(huán)糊精包合物制備

將β-環(huán)糊精溶于適量水中，攪拌加熱使其全部溶解，將溶解在少量無(wú)水乙醇中的薄荷油緩緩滴入冷卻至設(shè)定溫度的β-環(huán)糊精水溶液中，維持相應(yīng)預(yù)設(shè)溫度下，200 r/min磁力攪拌3～5 h，減壓濾過(guò)，分別用蒸餾水和無(wú)水乙醇洗滌，將濾渣30℃真空干燥，得到固體包合物。薄荷油-β-環(huán)糊精包合物按2010年版《中國(guó)藥典》(一部)附錄揮發(fā)油測(cè)定法測(cè)定，其包合率和收率的計(jì)算公式為100%

2.2 處方優(yōu)化設(shè)計(jì)［5］

在單因素考察實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇對(duì)包合物制備工藝影響顯著的3個(gè)因素即β-環(huán)糊精/薄荷油比例(w/v)(X1)、包合時(shí)間(X2)與包合溫度(X3)為因素，以所制備包合物的包合率和收得率為指標(biāo)，分別采用三因素三水平的正交設(shè)計(jì)及Box-Behnken設(shè)計(jì)安排實(shí)驗(yàn)。

2.2.1 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)正交設(shè)計(jì)［6］是利用“正交表”進(jìn)行科學(xué)地安排多因素試驗(yàn)的設(shè)計(jì)方法，是從是從全部試驗(yàn)方案中挑選出代表性強(qiáng)的一部分試驗(yàn)方案，通過(guò)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的分析，推斷出相對(duì)“最優(yōu)方案”。具有“均勻分散性、整齊可比性”的特征。但通過(guò)正交設(shè)計(jì)得到的“最優(yōu)方案”未必是各因素所有水平可能組合中的真正最優(yōu)結(jié)果，有時(shí)只說(shuō)明一個(gè)最優(yōu)的方向，還需要進(jìn)一步試驗(yàn)，從而分析各因素對(duì)指標(biāo)的影響大小及變化規(guī)律。正交試驗(yàn)安排及結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 薄荷油-β-環(huán)糊精包合物正交試驗(yàn)結(jié)果

通過(guò)直觀分析得出最優(yōu)的制備工藝條件是:A1B1C2和A2B1C2，綜合方差分析結(jié)果及各因素對(duì)變量的影響情況，故結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際考慮，選擇條件為A2B1C2即β-CD:揮發(fā)油用量比例為8∶1，包合時(shí)間為3 h，包合溫度為45℃為最佳制備工藝。

2.2.2 Box-Behnken設(shè)計(jì)

Box-Behnken［7］實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)法是一種基于三水平的二階實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)法，可以評(píng)價(jià)指標(biāo)和因素間的非線性關(guān)系，可以尋找出優(yōu)化區(qū)域，建立優(yōu)化區(qū)域的模型，從而找到響應(yīng)的優(yōu)化值。采用BBD這種方法可對(duì)包合物制備中各獨(dú)立因素及其交互作用對(duì)所考察指標(biāo)(收率與包合率)的影響進(jìn)行綜合分析，建立數(shù)學(xué)模型并作出相應(yīng)的三維應(yīng)變量曲面圖，對(duì)因素與指標(biāo)的關(guān)系進(jìn)行直觀的量化分析。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及安排見(jiàn)表2。

按照Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)統(tǒng)計(jì)學(xué)要求，將因素與響應(yīng)值進(jìn)行方程擬合，并以擬合優(yōu)度(R2)和置信度(P)作為模型判定標(biāo)準(zhǔn)。實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛿M合二次多項(xiàng)式方程表達(dá)式為:

表2 薄荷油-β-環(huán)糊精包合物box-behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

圖1 不同因素對(duì)響應(yīng)值(包封率、收率)影響的效應(yīng)曲面

Y=A0+A1X1+A2X2+A3X3+A4X1X2+A5X2X3+A6X1X3+A7X12+A8X22+A9X32其中Y為響應(yīng)值(包合率、收得率)，A為方程系數(shù)，X為各自變量編碼值。

Y包合率=76.58+3.25X1+0.59X2－1.49X3+2.95 X1X2-7X1X3+1.62X2X3+1.95X12-2.78X22－7.43 X3

2(R2=0.666 9，P=0.286 2＞0.05)

Y收率=78.88-8.47X1+1.13X2+0.63X3+1.77 X1X2－0.98X1X3+6.23X2X3+0.75X12－7.4X22－6.4X32(R2=0.980 8，P＜0.000 1)

從效應(yīng)曲面圖中可以看出，隨β-環(huán)糊精用量與揮發(fā)油比例增加時(shí)，包合率呈增加趨勢(shì);當(dāng)包合時(shí)間與包合溫度增加時(shí)，包合率呈先增加后減少趨勢(shì)，意味著在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，所選擇的時(shí)間與溫度中存在一個(gè)極值，通過(guò)對(duì)效應(yīng)面的分析能判斷各因素對(duì)響應(yīng)值的影響。但從包合率的回歸方程來(lái)看，經(jīng)F值檢驗(yàn)顯示方程不顯著(R2=0.666 9，P＞0.05)，說(shuō)明所選擇的三個(gè)因素的不同水平在該范圍內(nèi)對(duì)包合率影響沒(méi)有顯著性差異。從收率的回歸方程來(lái)看，經(jīng)F值檢驗(yàn)顯示方程顯著(R2=0.980 8，P＜0.000 1)，表明該回歸模型的擬合情況良好，回歸方程的代表性較好，能準(zhǔn)確的預(yù)測(cè)實(shí)際情況。隨β-環(huán)糊精用量與揮發(fā)油比例增加時(shí)，收率呈降低趨勢(shì)，在包合時(shí)間與包合溫度對(duì)收率影響過(guò)程中，隨兩者增加時(shí)，收率呈先增加后減少趨勢(shì)，提示在最佳處方附近，效應(yīng)與因素之間的關(guān)系變得非常敏感，實(shí)驗(yàn)條件的微小變化會(huì)造成指標(biāo)的較大改變，效應(yīng)和因素在此區(qū)域內(nèi)的關(guān)系一般表現(xiàn)為非線性;因此可通過(guò)預(yù)先設(shè)定目標(biāo)對(duì)處方進(jìn)行優(yōu)化。

在包合物制備過(guò)程中，要求所制備包合物的包合率和收率值越大越好，即希望Y包合率與Y包合率存在著極大值;采用Design Expert軟件對(duì)處方進(jìn)行優(yōu)化，得出最優(yōu)處方為揮發(fā)油:β-CD用量比例為1∶6，包合時(shí)間為3.4 h，包合溫度為45.78℃為最佳制備工藝。

通過(guò)兩種方法的比較，可以看出正交實(shí)驗(yàn)所需實(shí)驗(yàn)次數(shù)少，相對(duì)簡(jiǎn)單，但當(dāng)需要控制影響因素微小變化而響應(yīng)值變化較大時(shí)，采用正交實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生的偏差較大。與之相對(duì)的box-behnken設(shè)計(jì)通過(guò)對(duì)效應(yīng)曲面的分析與評(píng)價(jià)，更加形象直觀，而且通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析手段增加了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。因此BBD在實(shí)驗(yàn)條件尋優(yōu)過(guò)程中，可以連續(xù)的對(duì)實(shí)驗(yàn)的各個(gè)水平進(jìn)行分析，而正交實(shí)驗(yàn)只能對(duì)一個(gè)個(gè)孤立的實(shí)驗(yàn)點(diǎn)進(jìn)行分析。

2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

為了確定建立模型與實(shí)驗(yàn)結(jié)果是否相符，通過(guò)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)對(duì)模型的可靠性進(jìn)行檢驗(yàn)。在驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中，各因素取值為上述確定的最優(yōu)條件，分別按照正交設(shè)計(jì)與box-behnken設(shè)計(jì)進(jìn)行驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)，3批正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果中收率的結(jié)果為82.41%、81.79%、82.16%;包合率結(jié)果為85%、85%、87%;box-behnken設(shè)計(jì)結(jié)果收率和包合率其值分別為86.7%、81%，與模型預(yù)測(cè)值相比較低于3%，證明用兩種方法來(lái)尋求薄荷油-β-環(huán)糊精包合物最佳制備工藝都是可行的。

3 討論

3.1 國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)報(bào)道中［8］，揮發(fā)油-β-環(huán)糊精包合工藝常用正交設(shè)計(jì)的方法選擇較佳工藝，由于實(shí)驗(yàn)次數(shù)少，數(shù)據(jù)處理和操作都較方便，其應(yīng)用已達(dá)到普及的程度，以正交實(shí)驗(yàn)為例，是基于線性模型設(shè)計(jì)的方法，影響因素與效應(yīng)值之間有時(shí)可能不是線性關(guān)系，若忽略這種情況簡(jiǎn)單進(jìn)行線性模式設(shè)計(jì)，則會(huì)很大程度上與真實(shí)值偏離，而B(niǎo)ox-behnken設(shè)計(jì)運(yùn)用效應(yīng)曲面模型進(jìn)行分析，基于非線性模式進(jìn)行設(shè)計(jì)和研究，考慮了試驗(yàn)的隨機(jī)誤差，同時(shí)將復(fù)雜的未知的函數(shù)關(guān)系在小區(qū)域內(nèi)用簡(jiǎn)單的一次或二次多項(xiàng)式模型來(lái)擬合。為此BBD對(duì)目標(biāo)值擬和更為精確，響應(yīng)曲面的描繪細(xì)致，適合于當(dāng)影響因素少許變化時(shí)目標(biāo)值響應(yīng)特別敏感的非線性部分。

3.2 對(duì)各實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的數(shù)據(jù)處理方法的比較認(rèn)為:正交設(shè)計(jì)數(shù)據(jù)處理由于采用極差分析，通過(guò)簡(jiǎn)單加合計(jì)算即可，最為便利［1］;通過(guò)方差分析考察各因素之間是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而B(niǎo)BD需進(jìn)行多元線性回歸求得擬和方程，數(shù)學(xué)過(guò)程略為復(fù)雜，通過(guò)軟件的輔助處理，使數(shù)據(jù)處理變得方便，但需要一定的統(tǒng)計(jì)學(xué)知識(shí)作為基礎(chǔ)。

3.3 雖然通過(guò)box-behnken設(shè)計(jì)對(duì)目標(biāo)值的預(yù)測(cè)能力較強(qiáng)，可以得出最優(yōu)處方，但如果需要多種因素，會(huì)使實(shí)驗(yàn)次數(shù)成倍增長(zhǎng)，因而在使用響應(yīng)面優(yōu)化法之前，應(yīng)當(dāng)確定合理的實(shí)驗(yàn)因素與水平，使設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)點(diǎn)包括最佳的實(shí)驗(yàn)條件。再者通過(guò)BBD設(shè)計(jì)所預(yù)測(cè)出的是一個(gè)優(yōu)化區(qū)域范圍，也就意味著在此范圍內(nèi)的所有因素都可以作為最佳工藝，不具有唯一性。對(duì)于如何生成良好的或穩(wěn)定的設(shè)計(jì)方案，還不存在通用的基本原則，提示必要時(shí)還需與其它設(shè)計(jì)一起聯(lián)合應(yīng)用，以達(dá)到優(yōu)化設(shè)計(jì)目的。

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