黎 強(qiáng)，張曉娟，鐘明利

(1.廣西壯族自治區(qū)玉林食品藥品檢驗(yàn)所，廣西 玉林 537000; 2.廣西桂林醫(yī)學(xué)院，廣西 桂林 541004)

高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定清濁祛毒丸中咖啡酸、虎杖苷、丹皮酚含量

黎 強(qiáng)1，張曉娟1，鐘明利2

(1.廣西壯族自治區(qū)玉林食品藥品檢驗(yàn)所，廣西 玉林 537000; 2.廣西桂林醫(yī)學(xué)院，廣西 桂林 541004)

目的建立同時(shí)測(cè)定清濁祛毒丸中咖啡酸、虎杖苷和丹皮酚含量的高效液相色譜法。方法采用Agilent Eclipse XDB－C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，用甲醇 －0.1%磷酸流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，流速 1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng) 314 nm，進(jìn)樣量 5 μL。結(jié)果咖啡酸、虎杖苷和丹皮酚質(zhì)量濃度線性范圍分別是 4.8 ～96.0 μg/mL(r=0.999 5， n=5)，4.1 ～82.0 μg/mL(r=1.0， n=5)和 12.0 ～240.0 μg/mL(r=0.999 9，n=5)，平均加樣回收率分別為 101.10%(RSD=1.6% ，n=9)，101.62%(RSD=0.8% ，n=9)，102.71%(RSD=1.2% ，n=9)。結(jié)論該法方便、快捷、準(zhǔn)確、靈敏、重現(xiàn)性好，能更全面地控制清濁祛毒丸的質(zhì)量。

清濁祛毒丸;咖啡酸;虎杖苷;丹皮酚;高效液相色譜;含量

The linear ranges of caffeic acid，polydatin and paeonol were 4.8 － 96.0 μg/mL(r=0.999 5， n=5)，4.1 － 82.0 μg/mL(r=1.0， n=5)and 12.0 － 240.0 μg/mL(r=0.999 9， n=5)，respectively.The average recovery rates were 101.62% (RSD=0.8% ， n=9)for polydatin，101.10% (RSD=1.6% ， n=9)for caffeic acid and 102.71%(RSD=1.2% ， n=9)for paeonol respectively.Conclusion The method is simple，rapid，accurate and sensitive with good reproducibility，which is suitable for fully controlling the quality of Qingzuoqudu Pills.Key words:Qingzhuoqudu pills;caffeic acid;polydatin;paeonol;HPLC;content determination

清濁祛毒丸由蒲公英、牡丹皮、虎杖、地黃、山茱萸等12味中藥制成，能清熱解毒、利濕祛暑，用于治療濕熱下注所致尿頻、尿急、尿痛等?，F(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中其質(zhì)量控制方法為用紫外分光光度法測(cè)定丹皮酚的含量[1]，但該法操作較為煩瑣。本試驗(yàn)用高效液相色譜(HPLC)法同時(shí)測(cè)定清濁祛毒丸的咖啡酸、虎杖苷和丹皮酚含量，能更全面地控制清濁祛毒丸的質(zhì)量。

1 儀器與試藥

1100 Series高效液相色譜儀(安捷倫);TU－1221型紫外－可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京普析通用);AE240型電子分析天平(梅特勒－托利多);SB2200型超聲清洗器(上海必能信超聲有限公司)。對(duì)照品咖啡酸(批號(hào)為 885－200001)，虎杖苷(批號(hào)為 111575－200301);丹皮酚(批號(hào)為0780－9704)，均由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供;甲醇、磷酸(色譜純)，一級(jí)純化水;清濁祛毒丸(批號(hào)為081102，090701，090801，090504，廣西玉林大清藥業(yè)有限公司);大血藤、蒲公英、牡丹皮、虎杖、地黃、山茱萸等12味藥材(市售品)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱為 AgilentEclipse XDB －C18柱 (250 mm ×4.6 mm，5 μm)，以甲醇為流動(dòng)相 A，0.1% 磷酸為流動(dòng)相B，按表1進(jìn)行梯度洗脫，流速為 1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為314 nm，柱溫40℃，進(jìn)樣量5 μL。在上述色譜條件下，3個(gè)組分峰與相鄰色譜峰的分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)按咖啡酸、虎杖

表1 梯度洗脫條件

2.2 溶液制備

取清濁祛毒丸10袋，研成粉末，取約2.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇20 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理45 min，放冷，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，殘?jiān)偌?0 mL甲醇，稱定質(zhì)量，超聲處理10 min，放冷，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，合并濾液，用0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，續(xù)濾液即為供試品溶液。另分別取咖啡酸、虎杖苷和丹皮酚對(duì)照品適量，精密稱定，以甲醇為溶劑，制成質(zhì)量濃度分別為 0.143 4，0.515 6和1.840 8 g/L的對(duì)照品貯備液以及質(zhì)量濃度為咖啡酸4.11 mg/mL、虎杖苷4.8 mg/mL及丹皮酚1.2 mg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

陰性對(duì)照試驗(yàn):取按處方制備的分別不含蒲公英、虎杖和牡丹皮原藥材的樣品，按供試品溶液制備方法制備溶液試驗(yàn)。結(jié)果在咖啡酸、虎杖苷及丹皮酚的對(duì)應(yīng)峰位上未出現(xiàn)色譜峰，說(shuō)明陰性對(duì)照品溶液對(duì)測(cè)定無(wú)干擾(見(jiàn)圖1)。

圖1 高效液相色譜圖

線性關(guān)系考察:分別精密吸取混合對(duì)照品貯備液(咖啡酸4.11 mg/mL、虎杖苷 4.8 mg/mL，丹皮酚 1.2 mg/mL)0.1，0.2，0.4，1.0，2.0 mL，置 10 mL 量瓶中，以甲醇稀釋至刻度，搖勻，得系列質(zhì)量濃度的對(duì)照品混合溶液，進(jìn)樣測(cè)定峰面積，以對(duì)照品質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo)、峰面積(Y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程見(jiàn)表2。

表2 線性關(guān)系考察結(jié)果

精密度試驗(yàn):將混合對(duì)照品貯備液稀釋10倍，重復(fù)進(jìn)樣5次測(cè)定。結(jié)果峰面積、咖啡酸、虎杖苷和丹皮酚峰面積的 RSD分別為 0.8% ，0.2%，0.3%(n=5)。

穩(wěn)定性試驗(yàn):取同一供試品溶液，在室溫避光條件下，分別于0，2，4，8，12，24 h 時(shí)進(jìn)樣，考察保留時(shí)間及峰面積的一致性。測(cè)得樣品中咖啡酸、虎杖苷和丹皮酚峰面積的 RSD分別為1.4%，1.5% ，1.6%(n=6)。

重復(fù)性試驗(yàn):取同一批(批號(hào)為081102)清濁祛毒丸樣品，平行制備6份供試品溶液，進(jìn)樣分析。結(jié)果咖啡酸、虎杖苷和丹皮酚含量的平均值分別為 0.167 9，0.847 3，2.209 0 mg/g，RSD 分別為2.2% ，1.7%，2.3%。

加樣回收試驗(yàn):分別取已知含量的樣品(批號(hào)為081102)9份，每份約 1.0 g，精密稱定，分別精密加入混合對(duì)照品溶液 1.0，1.5，2.0 mL，每一濃度制備3份，揮干溶劑后測(cè)定各成分的含量并計(jì)算回收率?？Х人?、虎杖苷及丹皮酚的平均回收率為101.1%，101.6%，102.7%，RSD 分別為 1.6% ，0.8%，1.2%(n=9)。

2.4 樣品含量測(cè)定

另取3批樣品，依法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定峰面積以外標(biāo)法計(jì)算咖啡酸?；⒄溶占暗てし雍拷Y(jié)果見(jiàn)表3。

表3 樣品含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

虎杖苷又名白藜蘆醇苷，具有抗癌、抗菌消炎、抗氧化等生物學(xué)作用[2]，因其屬于二苯乙烯類化合物，在光照條件下不穩(wěn)定，容易向其異構(gòu)體或衍生物轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致含量降低，故須避光操作[3]。

取適當(dāng)濃度的咖啡酸、虎杖苷及丹皮酚對(duì)照品溶液，在波長(zhǎng)200～400 nm范圍內(nèi)做吸收光譜掃描，結(jié)果咖啡酸在323和217 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，虎杖苷在307和217 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，丹皮酚在314，274，228和213 nm波長(zhǎng)處有最大吸收。經(jīng)比對(duì)，各成分在314 nm波長(zhǎng)處吸收較好，故最后選擇314 nm為測(cè)定波長(zhǎng)。

在色譜條件篩選試驗(yàn)中，對(duì)流動(dòng)相比例及酸度、梯度洗脫時(shí)間、柱溫以及進(jìn)樣量做了考察，結(jié)果以本試驗(yàn)的色譜條件為最佳。

提取方法[4－6]選擇時(shí)，樣品中咖啡酸的含量較少，故需要加大取樣量?？疾炝思状?、50%甲醇、乙醇等溶劑，發(fā)現(xiàn)甲醇的提取效率最高。而提取方法以超聲提取效果最好，并且二次超聲提取效率最高。故確定提取方法為超聲處理45 min，過(guò)濾后殘?jiān)偌?0 mL甲醇超聲處理10 min，合并濾液。

[1]WS－10279(ZD －0279)－2002，國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)(試行)[S].

[2]劉樹(shù)興，程麗英.虎杖有效成分的開(kāi)發(fā)現(xiàn)狀及展望[J].食品科技，2005(2):96－98.

[3]馬麗艷，劉彥雷，梁學(xué)軍，等.貯藏條件對(duì)葡萄酒中白藜蘆醇的影響[J].中外葡萄與葡萄酒，2005(6):9.

[4]曾秋華，劉文京，唐曉暉.高效液相色譜法測(cè)定蒲公英顆粒中咖啡酸含量[J].中國(guó)藥業(yè)，2007，l6(3):26.

[5]周丹丹，趙云麗，張 艷，等.RP－HPLC法同時(shí)測(cè)定乙肝舒康膠囊中虎杖苷和二苯乙烯苷含量[J].藥物分析雜志，2008，28(3):411.

[6]張翠英，李忠保，李振國(guó)，等.HPLC測(cè)定六昧地黃顆粒中馬錢(qián)苷和丹皮酚含量[J].中成藥，2008，30(12):1 791 －1 794.

Simultaneous Determination of Caffeic Acid，Polydatin and Paeonol in Qingzhuoqudu Pills by HPLC

Li Qiang1， Zhang Xiaojuan1， Zhong Mingli2
(1.Yulin Institute for Food and Drug Control， Yulin， Guangxi， China 537000; 2.Guilin Medical College， Guilin， Guangxi， China 541004)

ObjectiveTo establish a HPLC method for simultaneous determination of caffeic acid，polydatin and paeonol in Qingzhuoqudu Pills.Methods The Agilent Eclipse XDB － C18column(250 mm ×4.6 mm，5 μm)was used with the mobile phase of methanol－0.1%phosphoric acid.The flow rate was 1.0 mL/min and the UV detection wavelength was set at 314 nm.The sample size was 5 μL.Results

R284.1;R286.0

A

1006－4931(2011)10－0038－02

2010－03－12)