湯京義

(泰山醫(yī)學(xué)院附屬新泰醫(yī)院，山東 新泰 271200)

內(nèi)毒素是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的一種耐熱脂多糖，它的污染性強(qiáng)，而且穩(wěn)定。當(dāng)內(nèi)毒素污染血液制品、生物制品和藥品后，如果應(yīng)用可引起機(jī)體發(fā)冷發(fā)熱，白細(xì)胞下降，血管通透性增加等“熱原質(zhì)反應(yīng)”。長期以來國內(nèi)外檢測熱原均采用家兔法。但是，家兔法常常因?yàn)閯游飩€體差異而影響到實(shí)驗(yàn)結(jié)果，同時造成人力和物力浪費(fèi)等。細(xì)菌內(nèi)毒素能激活鱟試劑中的凝固酶原產(chǎn)生凝集反應(yīng)形成凝膠。1985年我國衛(wèi)生部批準(zhǔn)將鱟試驗(yàn)法用于血液制品生產(chǎn)流程中控制內(nèi)毒素污染。凝膠鱟試劑檢測采血袋內(nèi)毒素，具有特異性好、靈敏度高、簡便等優(yōu)點(diǎn)。因此，我院采用鱟試劑，利用凝膠法和動態(tài)濁度法，對采血用的一次性耗材——采血袋進(jìn)行熱原檢測，對兩種檢測方法進(jìn)行比較，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1凝膠法材料和試劑 血液保存液Ⅱ、紅細(xì)胞添加劑，37℃水浴箱，漩渦振蕩儀，無菌安瓶。鱟試劑靈敏度0.25 EU/ml，細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品，無菌檢測用水。

1.2動態(tài)濁度法材料和試劑 1ET-24A細(xì)菌內(nèi)毒素檢測儀(天津天大開發(fā)公司生產(chǎn))。鱟試劑盒(湛江博康海洋生物有限公司生產(chǎn))。

1.3方法

1.3.1凝膠法

1.3.1.1鱟試劑靈敏度復(fù)核 用細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品，按照生物制品細(xì)菌內(nèi)毒素試驗(yàn)操作規(guī)程2.1進(jìn)行操作[2]。

1.3.1.2供試品干擾試驗(yàn) 用血液保存液Ⅱ，按照生物制品細(xì)菌內(nèi)毒素試驗(yàn)操作規(guī)程2.2進(jìn)行操作[2]。

1.3.1.3供試品內(nèi)毒素檢測 試驗(yàn)直接用0.1 ml試劑瓶進(jìn)行操作，方法嚴(yán)格按照試劑說明書操作。

1.3.2動態(tài)濁度法

1.3.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線制作 首先將標(biāo)準(zhǔn)品溶解稀釋成2.0 EU/ml、1.0 EU/ml、0.5 EU/ml、0.125 EU/ml，加樣按照試劑說明書操作。加樣完畢封口安瓶，將試管在漩渦儀上振蕩1～3秒，將安瓶對應(yīng)插入已經(jīng)恒溫(37℃)的定量檢測儀，儀器自動采集數(shù)據(jù)。

1.3.2.2供試品干擾試驗(yàn)用回收率判斷 按照所得線性回歸方程分別計(jì)算供試品溶液和含標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素的供試品的溶液的內(nèi)毒素含量Ct和Cs,再按下式計(jì)算該試驗(yàn)條件下的回收率(R)：R=( Cs-Ct)/ λm×100%。當(dāng)內(nèi)毒素的回收率在50%～100%之間，則認(rèn)為在此試驗(yàn)條件下供試品溶液不存在干擾作用。

1.3.2.3供試品內(nèi)毒素檢測 試驗(yàn)嚴(yán)格按照試劑盒說明加樣，儀器使用嚴(yán)格按照ET-24A細(xì)菌內(nèi)毒素檢測儀使用說明進(jìn)行。

2 結(jié) 果

2.1凝膠法

2.1.1凝膠法靈敏度復(fù)核結(jié)果 見表1。

表1 凝膠法靈敏度復(fù)核結(jié)果

注：λ=0.25 EU/ml，λc=lg-1[(0.5λ)+3(λ)]/4=0.214。當(dāng)λc在0.5λ～2.0λ時方可用于細(xì)菌內(nèi)毒素檢查,并以λ為該批試劑的靈敏度。

2.1.2凝膠法干擾試驗(yàn)結(jié)果 見表2。供試品最大稀釋倍數(shù)(MVD)按照下列公式計(jì)算：MVD=CL/λ=5.6/0.25=20倍，L為供試品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值，C為供試品濃度，當(dāng)L以EU/ml 表示時C為1.0ml/ml。

表2 凝膠法干擾試驗(yàn)結(jié)果

注：Es在0.5λ～2.0λ，且Et在0.5 Es～2.0 Es，認(rèn)為供試品在該濃度下無干擾作用。

細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水制成的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)的反應(yīng)終點(diǎn)內(nèi)毒素濃度的幾何平均值為0.25λ≤ES≤2.0λ，且當(dāng)MVD稀釋的樣品液制成的內(nèi)毒素與標(biāo)準(zhǔn)液反應(yīng)終點(diǎn)內(nèi)毒素的幾何平均值為0.25λ≤Et≤2.0λ時，則認(rèn)為MVD下無干擾供試品檢測結(jié)果判定;將安瓶從水浴箱輕輕取出，緩緩倒轉(zhuǎn)180℃時，凝膠不變形，不從安瓶壁滑脫為陽性。凝膠不能保持完整并從壁滑脫為陰性。

2.3動態(tài)濁度法 標(biāo)準(zhǔn)曲線有效條件，當(dāng)陰性對照的時間大于標(biāo)準(zhǔn)曲線最低濃度反應(yīng)時間，將全部數(shù)據(jù)進(jìn)行線性回歸分析。根據(jù)線性回歸分析，標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)(r)的絕對值大于或等于0.98，試驗(yàn)有效(表3)。

表3 動態(tài)濁度法標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果分析

2.3.1標(biāo)準(zhǔn)曲線LgT=2.9783-0.2621LgC,相關(guān)系數(shù)r=0.999符合規(guī)定。

2.3.2干擾試驗(yàn) 以樣品濃度C=1.0 ml/ml，稀釋倍數(shù)20為例，計(jì)算該濃度下的回收率(R)：

R=( Cs-Ct)/ λm×100%=(0.502-0)/0.5×100%=100.40%

2.3.3供試品檢測結(jié)果 儀器直接顯示：試驗(yàn)有效條件(1)標(biāo)準(zhǔn)曲線要符合r值大于或等于0.98要求；(2)計(jì)算出的內(nèi)毒素的回收率要在50%～200%的范圍內(nèi)；(3)陰性對照的反應(yīng)時間大于標(biāo)準(zhǔn)曲線最低濃度的反應(yīng)時間。符合以上三個條件后，若供試品溶液所有平行安瓶的平均內(nèi)毒素濃度乘以稀釋倍數(shù)后，小于規(guī)定的內(nèi)毒素限值，判斷供試品符合規(guī)定。若大于或等于規(guī)定的內(nèi)毒素限值，判斷供試品不符合規(guī)定。

3 討 論

通過近1年的比較觀察驗(yàn)，動態(tài)濁度法和凝膠法有不同點(diǎn)，比較見表4。

定量法的特點(diǎn)(1)通過反應(yīng)曲線，直觀顯示鱟試劑的反應(yīng)過程；通過反應(yīng)曲線，考察樣本中的干擾。(2)快速、準(zhǔn)確測到樣品中的內(nèi)毒素含量，有利于原輔材料的質(zhì)量控制；也可以作為原輔材料招標(biāo)的依據(jù)；本設(shè)備軟件還可以檢測病人和血液中的內(nèi)毒素含量，作為判斷細(xì)菌污染血液的依據(jù)。(3)操作簡單、可靠性高。

試驗(yàn)注意事項(xiàng)：凝膠法試驗(yàn)前工作人員手要清潔消毒，試驗(yàn)操作應(yīng)在潔凈工作臺進(jìn)行。在使用洗耳球、移液管取樣時，要注意不要將空氣吸入溶液中，防止氣體中的內(nèi)毒素進(jìn)入供試品。由于凝膠反應(yīng)是不可逆的，所以在反應(yīng)過程中及觀察結(jié)果時注意不要使試管受到振蕩，以免使凝膠破碎產(chǎn)生假陰性。

溫度對鱟試劑有影響：鱟血蛋白酶的最適反應(yīng)溫度35～40℃，國際標(biāo)準(zhǔn)37℃。在一定范圍(21～41℃)內(nèi)當(dāng)溫度升高時，反應(yīng)速度也升高，25℃時反應(yīng)速度已經(jīng)相當(dāng)快，因此內(nèi)毒素與鱟試劑混合液不等進(jìn)入反應(yīng)儀器，反應(yīng)已開始，特別注意在夏天室溫較高時縮短操作時間，盡快放入儀器中。

pH值對鱟試劑有影響：鱟試劑與內(nèi)毒素反應(yīng)的最適pH值為6.5～8.0；pH≤3或≥10時酶活性受抑制。所以排除干擾的方法對供試品進(jìn)行最大倍數(shù)稀釋，先在樣品中加入一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素，還需要經(jīng)過堿性調(diào)節(jié)劑處理后，才能進(jìn)行試驗(yàn)。

金屬離子和弱酸陰離子對鱟試劑有影響：離子對細(xì)菌內(nèi)毒素測定結(jié)果影響較大，一方面陽離子如Fe 、AI強(qiáng)度較大會引起內(nèi)毒素的聚集，造成內(nèi)毒素局部濃度過高，同時高離子濃度對鱟試劑反應(yīng)有強(qiáng)抑制作用。所以試驗(yàn)時一定作用檢測用水的試用和試用一次無熱源的吸頭。

動態(tài)濁度法加樣注意：樣品的稀釋、內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋倍數(shù)每步不應(yīng)大于10倍，否則影響試驗(yàn)的準(zhǔn)確性。樣品的預(yù)處理過程，不同廠家、不同品種的保存液需要加入的調(diào)節(jié)液的量不同，試驗(yàn)中加入的調(diào)節(jié)液應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況而定。

表4 動態(tài)濁度法和凝膠法對細(xì)菌內(nèi)毒素檢測的比較

動態(tài)濁度法加樣檢測的過程：實(shí)驗(yàn)中所應(yīng)用的動態(tài)濁度反應(yīng)時間法，記錄的反應(yīng)時間和溶液中的內(nèi)毒素濃度的對應(yīng)關(guān)系。那么，從樣品溶液和鱟試劑溶液混合的那一刻開始，反應(yīng)已經(jīng)啟動。所以，加樣后反應(yīng)立即放入儀器內(nèi)，盡可能減少因試驗(yàn)加樣速度造成的誤差。

試驗(yàn)環(huán)境要求在潔凈的工作臺進(jìn)行，減少誤差。

試驗(yàn)誤差：鱟試劑靈敏度有差異，不同廠家的鱟試劑雖然標(biāo)示值(λ)相同，但是差異較大，因?yàn)榘?.5λ～2λ誤差標(biāo)準(zhǔn)都是合格產(chǎn)品；細(xì)菌內(nèi)毒素工作品效價有誤差；實(shí)驗(yàn)操作有誤差，如加樣槍、試驗(yàn)環(huán)境、操作程序都可能引起試驗(yàn)結(jié)果的誤差，應(yīng)引起注意。

總之，細(xì)菌內(nèi)毒素試驗(yàn)?zāi)z定性法與動態(tài)濁度定量法，都是藥典規(guī)定的方法，凝膠定性法不需要增加設(shè)備。動態(tài)濁度定量法需要設(shè)備，但是靈敏度高，能快速、準(zhǔn)確測到樣品中的內(nèi)毒素含量，結(jié)果能保存，對原輔材料控制中，有可以追溯性的數(shù)據(jù)。所以有條件的血站在檢測內(nèi)毒素試驗(yàn)時還是采用濁度定量法。

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[M].2005年版，二部.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005： 262.

[2] 藥品生物制品鑒定所.中國藥品檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程[M].北京：中國醫(yī)藥科技電子出版社,2005:278.

[3] 中國國家藥品監(jiān)督管理局.中國生物制品暫行規(guī)程[J].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2000:37-44.