黃曉磊 王曉東

(泰山醫(yī)學(xué)院附屬泰山醫(yī)院，山東 泰安 271000 )

糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN) 為糖尿病性微血管病變所致，病理學(xué)特征性改變表現(xiàn)為腎臟肥大、腎小球和腎小管基底膜增厚、細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)積聚致系膜區(qū)擴(kuò)張,最后導(dǎo)致腎小球硬化、間質(zhì)纖維化[1]。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是一種內(nèi)皮細(xì)胞特異性的絲裂原，已發(fā)現(xiàn)VEGF與DN發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[2-3]。本研究我們應(yīng)用丹參(Salvia miltiorrhiza)對(duì)糖尿病大鼠進(jìn)行干預(yù)，觀察該藥對(duì)大鼠生化指標(biāo)和腎組織VEGF表達(dá)的影響，探討其治療糖尿病腎病可能的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

普通級(jí)雄性Wistar大鼠40只，體質(zhì)量180～220 g[山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。合格證號(hào):SCXK(魯) 20050015)]；丹參注射液(三九醫(yī)藥股份有限公司產(chǎn)品)；鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ，Sigma公司)，批號(hào)S-0130規(guī)格100 mg；VEGF一抗及免疫組化試劑盒(PV-6001)(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1建立糖尿病大鼠模型 所有大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，禁食12 h，隨機(jī)取28只大鼠，將STZ溶于0.1 mmol/L、pH 4.2的無(wú)菌枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖液中，配制成10 g/L的STZ，按50 mg/kg一次性腹腔注射，72 h后經(jīng)尾靜脈取血測(cè)血糖，連續(xù)3次血糖≥16.7 mmol/L者達(dá)到模型標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)照組僅注射等量的枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖液。

1.2.2動(dòng)物分組及給藥劑量 將成模的24只大鼠隨機(jī)分成糖尿病模型組和丹參治療組，每組12只。將預(yù)留的12只大鼠設(shè)為正常對(duì)照組。丹參治療組自成模之日起按15 g·(kg·d)-1予以灌胃，糖尿病模型組和正常對(duì)照組給予等體積的蒸餾水灌胃，1次/d，連續(xù)8周。 所有大鼠在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間喂標(biāo)準(zhǔn)飲食，自由飲水，不用胰島素。

1.2.3標(biāo)本收集 ①大鼠精神狀態(tài)、飲食、毛色、體重(每周記錄1次)。②每周尾靜脈采血測(cè)外周血血糖1次。③大鼠處死前1 d放入代謝籠，準(zhǔn)確收集24 h尿液，離心分裝后保存于-70℃冰箱中待測(cè)尿蛋白、尿肌酐。④于實(shí)驗(yàn)8周末在戊巴比妥腹腔注射麻醉下經(jīng)股動(dòng)脈收集血標(biāo)本，保存于-40℃冰箱中待測(cè)血糖、血肌酐、尿素氮、膽固醇。經(jīng)心臟注入4℃預(yù)冷的生理鹽水反復(fù)灌洗，至整個(gè)腎臟顏色變蒼白后游離，置于冰上，取8 mm3大小腎組織置于40 g/L多聚甲醛溶液中固定，石蠟包埋，制成厚度為4 μm切片，行HE染色。同時(shí)行多聚賴(lài)氨酸處理切片，進(jìn)行免疫組化研究。

1.2.4尿白蛋白排泄率與肌酐清除率測(cè)定 采用EIA測(cè)定尿白蛋白含量，尿白蛋白排泄率(urine albumin excretion rate，UAER)為尿白蛋白含量與24 h尿量乘積；內(nèi)生肌酐清除率(Ccr)按照下列公式計(jì)算：Ccr(ml/min)=Ucr(μmol/L)×V(ml) / Scr(μmol/L)×1440(min)，并用體重(100 g)校正。其中Ucr,Scr,V分別代表尿肌酐、血肌酐濃度、24 h尿量。

1.2.5免疫組織化學(xué)采用即用型二步法(非生物素) 石蠟切片常規(guī)脫蠟，分級(jí)乙醇水化后行微波爐抗原修復(fù)15min，按即用型二步法檢測(cè)試劑盒(PV-6001)說(shuō)明進(jìn)行免疫組織化學(xué)操作，VEGF多克隆抗體的稀釋度為1︰100。顯色時(shí)間為5 min，蒸餾水沖洗終止反應(yīng)，中性樹(shù)膠封片，鏡下觀察。VEGF抗體染色以胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性信號(hào)。每例標(biāo)本1張切片, 每張切片高倍鏡下(×400)隨機(jī)選擇2～3個(gè)視野的腎小球及腎小管-間質(zhì), 采用Image-proplus 5.0圖像分析系統(tǒng)測(cè)定該區(qū)域平均吸光度值, 取其平均吸光度均值作為結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 一般狀況

正常對(duì)照組大鼠精神狀態(tài)良好、毛色光澤、進(jìn)食正常，體重逐漸增加。糖尿病模型組大鼠在實(shí)驗(yàn)期間均表現(xiàn)出多飲、多食、多尿、體重下降，生長(zhǎng)遲緩，精神萎靡，反應(yīng)遲鈍，毛發(fā)豎立無(wú)光澤，動(dòng)作遲緩，蜷臥拱背等癥狀，丹參治療組有類(lèi)似表現(xiàn)，但程度有所緩解。

2.2 一般生化指標(biāo)

糖尿病模型組大鼠表現(xiàn)為血糖升高、體重降低。丹參治療組大鼠與糖尿病模型組相比血糖有所下降，體重有所增加，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。糖尿病模型組大鼠BUN、CHO、UAER明顯高于正常對(duì)照組，Ccr明顯低于正常對(duì)照組。丹參治療8周大鼠BUN、CHO、UAER低于糖尿病模型組，Ccr高于模型組(表1)。

表1 各組大鼠臨床及代謝參數(shù)的比較

注：與正常對(duì)照組比較，aP<0.01；與糖尿病模型組比較，bP< 0.05,cP<0.01。

2.3 各組大鼠腎組織病理形態(tài)學(xué)變化

光鏡下觀察，正常對(duì)照組腎小球毛細(xì)血管襻開(kāi)放良好，未見(jiàn)腎小球節(jié)段硬化，腎小管上皮細(xì)胞排列整齊。糖尿病模型組腎小球體積增大，系膜區(qū)彌漫性增寬，細(xì)胞外基質(zhì)增多，系膜細(xì)胞增生，基底膜增厚，腎間質(zhì)有炎細(xì)胞浸潤(rùn)。丹參治療組腎小球輕度腫脹，系膜區(qū)輕度增寬，系膜細(xì)胞增生，基底膜增厚較糖尿病模型組明顯減輕。

2.4 各組大鼠腎組織VEGF表達(dá)變化

VEGF在正常對(duì)照組主要在腎小球臟層上皮細(xì)胞有微弱表達(dá)；在糖尿病模型組，腎小球VEGF表達(dá)明顯增加(P<0.01)，主要表達(dá)于腎小球系膜細(xì)胞、系膜區(qū)及上皮細(xì)胞，近曲小管也有微弱表達(dá)；在丹參治療組，上述增加的表達(dá)受到顯著抑制(P<0.05)。表達(dá)強(qiáng)度均采用平均光密度值(OD%值)作為結(jié)果記錄(表2)。

表2 各組大鼠腎組織VEGF的表達(dá)

注：與正常對(duì)照組比較,aP<0.01; 與糖尿病模型組比較,bP< 0.05。

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)采用STZ誘導(dǎo)大鼠糖尿病模型，8周后大鼠出現(xiàn)體質(zhì)量下降，相對(duì)腎質(zhì)量、尿素氮、膽固醇、尿蛋白排泄率增加，提示本模型已出現(xiàn)DN早期表現(xiàn)。丹參給藥8周對(duì)糖尿病大鼠血糖、體質(zhì)量無(wú)明顯影響，但改善了腎臟病理?yè)p害，減少了尿蛋白排泄率,增加了內(nèi)生肌酐清除率。研究表明丹參對(duì)實(shí)驗(yàn)性早期DN有明顯保護(hù)作用，我們進(jìn)一步探討丹參對(duì)DN保護(hù)作用的可能機(jī)制。丹參屬活血化瘀類(lèi)中藥，具有降低血黏度、抗凝、抗血栓、促進(jìn)纖溶、改善微循環(huán)等作用。

DN為糖尿病性微血管病變所致，已成為終末期腎衰竭最常見(jiàn)的病因，其主要病理特點(diǎn)是腎臟高灌注、腎小球基底膜增厚和以腎小球系膜區(qū)為主的ECM積聚，導(dǎo)致結(jié)節(jié)性或彌漫性腎小球硬化及小管間質(zhì)纖維化，出現(xiàn)蛋白尿、腎功能衰竭等功能紊亂。它的發(fā)生發(fā)展與血管內(nèi)皮功能障礙密切相關(guān)，其蛋白尿出現(xiàn)提示糖尿病腎病存在廣泛微血管損害[4-5]。VEGF在DN的發(fā)生發(fā)展中，已引起廣泛重視。VEGF可誘導(dǎo)腎小球基底膜細(xì)胞增生、分裂 。VEGF是內(nèi)皮細(xì)胞特異性的絲裂原，能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增生、遷移，與血管內(nèi)皮細(xì)胞上的受體結(jié)合，促進(jìn)新血管生成，增加血管通透性[6]。 Satchell等[7]發(fā)現(xiàn)VEGF可降低腎小球內(nèi)皮細(xì)胞的電阻達(dá)12.5 Ω/cm2，從而增加內(nèi)皮細(xì)胞的通透性。VEGF與組胺和緩激肽的作用相似，可直接引起血漿外滲，可致occludin蛋白絲氨酸或蘇氨酸殘基磷酸化，引起occludin降解或構(gòu)象改變，增加血管通透性。另外，VEGF可引起內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)改變，如質(zhì)膜囊泡和囊泡狀小體(VVOS)的形成和聚集，通過(guò)影響細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及胞間轉(zhuǎn)運(yùn)來(lái)調(diào)節(jié)蛋白尿的形成。VEGF與腎小球系膜細(xì)胞上的受體結(jié)合活化細(xì)胞內(nèi)MAP激酶信號(hào)傳遞系統(tǒng)，促進(jìn)系膜細(xì)胞合成ECM,還可促進(jìn)單核細(xì)胞及多種細(xì)胞因子從血漿中滲出，沉積于腎小球系膜區(qū)，促進(jìn)細(xì)胞增殖、ECM沉積，導(dǎo)致腎小球肥大。最近研究[8]表明糖尿病早期腎小球高濾過(guò)、腎小球和腎臟增大除上述原因外，常與腎小球?yàn)V過(guò)面積增加、新生血管生成有關(guān)，給予VEGF單克隆抗體或血管生成抑制劑(tumstatin)可緩解實(shí)驗(yàn)性糖尿病鼠腎高濾過(guò)、腎小球肥大、腎重和尿蛋白排泄，提示VEGF與糖尿病腎臟和DN階段的微血管結(jié)構(gòu)改變、血管新生有關(guān)。此外，VEGF還可誘導(dǎo)IGF-1、TGF-β、MCP-1、ET-1、PDGF等細(xì)胞因子的表達(dá)，參與DN的形成。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，丹參治療組大鼠VEGF在腎臟中的表達(dá)明顯低于模型組，其平均光密度較模型組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。證實(shí)丹參能降低VEGF在糖尿病大鼠腎臟中的表達(dá)，這可能是丹參治療DN的機(jī)理之一。

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