趙立紅

(泰山醫(yī)學(xué)院附屬泰山醫(yī)院檢驗(yàn)科，山東泰安 271000)

風(fēng)疹(rubella virus，RV)是披膜病毒科風(fēng)疹病毒屬的唯一成員，人是唯一的自然宿主。孕婦妊娠前3個(gè)月感染RV，RV會(huì)通過(guò)胎盤(pán)感染胎兒，導(dǎo)致孕婦流產(chǎn)或死胎，甚至引起新生兒一系列的器官畸形等先天性風(fēng)疹綜合征(congenital rubella syndrome，CRS)[1]。因此，采用及時(shí)準(zhǔn)確快捷的RV診斷方法具有十分重要的意義。我們采用TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法檢測(cè)孕婦血清標(biāo)本中風(fēng)疹病毒RNA，并與傳統(tǒng)方法-風(fēng)疹病毒免疫球蛋白M(IgM)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)進(jìn)行比較分析。

1 材料與方法

1.1金標(biāo)準(zhǔn)

細(xì)胞培養(yǎng)法

1.2臨床標(biāo)本

收集2008年6月至2010年10月泰安市中心醫(yī)院產(chǎn)前診斷門(mén)診細(xì)胞培養(yǎng)法確診的風(fēng)疹病毒陽(yáng)性孕婦血清標(biāo)本126例，年齡22～36歲，平均年齡28歲；正常對(duì)照組107例為女性健康查體者，無(wú)與風(fēng)疹病人接觸史，年齡24～29歲，平均年齡26歲。

1.3儀器與試劑

PE7500全自動(dòng)PCR擴(kuò)增分析儀為美國(guó)PE公司產(chǎn)品；風(fēng)疹病毒實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑盒購(gòu)自中山醫(yī)科大學(xué)達(dá)安基因診斷有限公司；DY-1型酶標(biāo)儀系美國(guó)BIO-TEK公司產(chǎn)品；風(fēng)疹病毒ELISA IgM試劑盒購(gòu)自美國(guó)羅氏公司。

1.4風(fēng)疹病毒ELISA IgM抗體測(cè)定

嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.5實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)風(fēng)疹病毒RNA。

嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。反應(yīng)條件：93℃預(yù)變性2min，然后93℃變性45s，55℃退火60s，先做10個(gè)循環(huán)，最后按93℃變性30s，55℃退火45s，做30個(gè)循環(huán)。于PE7500全自動(dòng)PCR擴(kuò)增分析儀上進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。

1.6陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)

實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR法

如果Ct值<27，則實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性。

ELISA IgM 抗體法

以待檢血清吸光度值(P)與陰性對(duì)照血清吸光度值(N)的比值P/N≥2.1為陽(yáng)性，波長(zhǎng)為450nm。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

直線回歸與相關(guān)、敏感度、特異度應(yīng)用SPSS 10.0軟件以及PEMS3.1軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié) 果

2.1定量陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)力學(xué)曲線及標(biāo)準(zhǔn)回歸曲線

10倍系列稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品cDNA(1.0×107-1.0×103拷貝/μl)在PE7500全自動(dòng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上擴(kuò)增后，系統(tǒng)根據(jù)熒光值的變化規(guī)律，自動(dòng)生成標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)力學(xué)曲線(圖1)。通過(guò)baseline 的設(shè)定，系統(tǒng)自動(dòng)生成標(biāo)準(zhǔn)回歸曲線(圖2)。由標(biāo)準(zhǔn)回歸曲線可以看出，該標(biāo)準(zhǔn)品不同稀釋度的各個(gè)有效反應(yīng)點(diǎn)均落在標(biāo)準(zhǔn)曲線的相應(yīng)位置上，線性相關(guān)系數(shù)r為-0.9991(r2=0.9982)，表明10倍系列稀釋的不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品cDNA的自然對(duì)數(shù)值與相應(yīng)的Ct值具有良好的相關(guān)性，證實(shí)了風(fēng)疹病毒RNA TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法定量的準(zhǔn)確性。

圖1 定量陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)力學(xué)曲線(基線下水平直線為陰性對(duì)照)

圖3 定量陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)回歸曲線(相關(guān)系數(shù)r2=0.9982)

2.2風(fēng)疹病毒實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR法檢測(cè)結(jié)果

風(fēng)疹病毒陽(yáng)性孕婦血清標(biāo)本126例，117例被檢出陽(yáng)性，9例假陰性；女性健康查體者107例，105例被檢出陰性，2例假陽(yáng)性。以細(xì)胞培養(yǎng)法作為金標(biāo)準(zhǔn)，風(fēng)疹病毒TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法的敏感度和特異度分別為92.9%，98.1%。

2.3ELISA IgM抗體法檢測(cè)結(jié)果

風(fēng)疹病毒陽(yáng)性孕婦血清標(biāo)本126例，123例被檢出陽(yáng)性，3例假陰性；女性健康查體者107例，93例被檢出陰性，14例假陽(yáng)性。以細(xì)胞培養(yǎng)法作為金標(biāo)準(zhǔn)，ELISA IgM抗體法的敏感度和特異度分別為97.6%，86.9%。

2.4實(shí)時(shí)熒光RT-PCR法與ELISA IgM抗體法兩種方法特異度和敏感度比較

實(shí)時(shí)熒光RT-PCR與ELISA IgM抗體法兩種方法特異度和敏感度，見(jiàn)表1。

表1 比較實(shí)時(shí)熒光RT-PCR法與ELISA IgM抗體法特異度和敏感度

檢測(cè)方法 特異度敏感度 實(shí)時(shí)熒光RT-PCR法98.1% 92.9%ELISA IgM抗體法86.9%97.6%

兩種方法敏感度進(jìn)行比較，u=1.75<1.96，p>0.05，因而，實(shí)時(shí)熒光RT-PCR與ELISA IgM抗體法兩種方法敏感度無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的差異。兩種方法特異度進(jìn)行比較，u=3.11>2.58，p<0.01，因而，實(shí)時(shí)熒光RT-PCR的特異度明顯高于ELISA IgM抗體法的特異度。

3 討 論

目前檢測(cè)風(fēng)疹多采用ELISA法測(cè)定患者血清中的特異性風(fēng)疹I(lǐng)gM抗體，該方法快速、靈敏，但容易引起假陽(yáng)性反應(yīng)。近年出現(xiàn)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，通過(guò)TaqMan探針雜交提高了特異性，引進(jìn)光譜技術(shù)進(jìn)行準(zhǔn)確定量，避免了交叉污染，使其成為基礎(chǔ)研究和分子生物學(xué)診斷領(lǐng)域最熱門(mén)的診斷技術(shù)之一[2]。Johanna采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)MMR疫苗病毒顆粒，證明其特異度與金標(biāo)準(zhǔn)-細(xì)胞培養(yǎng)法相似[3]。Chen等建立的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR診斷SARS-CoV 感染，其敏感度和特異度均非常高[4]。

本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)孕婦血清風(fēng)疹病毒RNA，并與ELISA法比較其敏感度與特異度，實(shí)驗(yàn)證明，兩種方法的敏感度無(wú)顯著性差異，實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR的特異度明顯高于ELISA法。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法彌補(bǔ)了常規(guī)PCR易產(chǎn)生假陽(yáng)性和不能定量?jī)纱蠹夹g(shù)缺陷。將其運(yùn)用于RV感染的早期臨床診斷，可以最大限度地減少死胎、畸胎等的發(fā)生率。由此可見(jiàn)，風(fēng)疹病毒RNA TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR是一種簡(jiǎn)便、快速、高特異性、高敏感性及定量準(zhǔn)確的檢測(cè)方法，在臨床風(fēng)疹早期診斷中具有很大的應(yīng)用潛力。

致謝：本研究得到了中山醫(yī)科大學(xué)達(dá)安基因公司的大力協(xié)助，在此表示衷心的感謝！

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[3] Johanna A C， Schalk , Christa van den Elzen ,et al. Estimation of the number of infectious measles viruses in live virus vaccines using quantitative real-time PCR[J]. J Virol Methods, 2004 ,117(2):179-187.

[4] Chen W, Xu Z, Mu J, et al. Real-time quantitative fluorescent reverse transcriptase-PCR for detection of severe acute respiratory syndrome-associated coronavirus RNA[J]. Molecular Diagnosis, 2004;8(4):231-235.