趙立紅

(泰山醫(yī)學院附屬泰山醫(yī)院檢驗科，山東泰安 271000)

風疹(rubella virus，RV)是披膜病毒科風疹病毒屬的唯一成員，人是唯一的自然宿主。孕婦妊娠前3個月感染RV，RV會通過胎盤感染胎兒，導致孕婦流產或死胎，甚至引起新生兒一系列的器官畸形等先天性風疹綜合征(congenital rubella syndrome，CRS)[1]。因此，采用及時準確快捷的RV診斷方法具有十分重要的意義。我們采用TaqMan探針實時熒光定量RT-PCR方法檢測孕婦血清標本中風疹病毒RNA，并與傳統方法-風疹病毒免疫球蛋白M(IgM)酶聯免疫吸附測定法(ELISA)進行比較分析。

1 材料與方法

1.1金標準

細胞培養(yǎng)法

1.2臨床標本

收集2008年6月至2010年10月泰安市中心醫(yī)院產前診斷門診細胞培養(yǎng)法確診的風疹病毒陽性孕婦血清標本126例，年齡22～36歲，平均年齡28歲；正常對照組107例為女性健康查體者，無與風疹病人接觸史，年齡24～29歲，平均年齡26歲。

1.3儀器與試劑

PE7500全自動PCR擴增分析儀為美國PE公司產品；風疹病毒實時熒光定量RT-PCR檢測試劑盒購自中山醫(yī)科大學達安基因診斷有限公司；DY-1型酶標儀系美國BIO-TEK公司產品；風疹病毒ELISA IgM試劑盒購自美國羅氏公司。

1.4風疹病毒ELISA IgM抗體測定

嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.5實時熒光定量RT-PCR檢測風疹病毒RNA。

嚴格按照試劑盒說明書操作。反應條件：93℃預變性2min，然后93℃變性45s，55℃退火60s，先做10個循環(huán)，最后按93℃變性30s，55℃退火45s，做30個循環(huán)。于PE7500全自動PCR擴增分析儀上進行 PCR 擴增。

1.6陽性判定標準

實時熒光定量RT-PCR法

如果Ct值<27，則實驗結果為陽性。

ELISA IgM 抗體法

以待檢血清吸光度值(P)與陰性對照血清吸光度值(N)的比值P/N≥2.1為陽性，波長為450nm。

1.7統計學處理

直線回歸與相關、敏感度、特異度應用SPSS 10.0軟件以及PEMS3.1軟件進行統計學分析。

2 結 果

2.1定量陽性標準動力學曲線及標準回歸曲線

10倍系列稀釋的標準品cDNA(1.0×107-1.0×103拷貝/μl)在PE7500全自動實時熒光定量PCR儀上擴增后，系統根據熒光值的變化規(guī)律，自動生成標準動力學曲線(圖1)。通過baseline 的設定，系統自動生成標準回歸曲線(圖2)。由標準回歸曲線可以看出，該標準品不同稀釋度的各個有效反應點均落在標準曲線的相應位置上，線性相關系數r為-0.9991(r2=0.9982)，表明10倍系列稀釋的不同濃度的標準品cDNA的自然對數值與相應的Ct值具有良好的相關性，證實了風疹病毒RNA TaqMan實時熒光定量RT-PCR方法定量的準確性。

圖1 定量陽性標準動力學曲線(基線下水平直線為陰性對照)

圖3 定量陽性標準回歸曲線(相關系數r2=0.9982)

2.2風疹病毒實時熒光定量RT-PCR法檢測結果

風疹病毒陽性孕婦血清標本126例，117例被檢出陽性，9例假陰性；女性健康查體者107例，105例被檢出陰性，2例假陽性。以細胞培養(yǎng)法作為金標準，風疹病毒TaqMan實時熒光定量RT-PCR方法的敏感度和特異度分別為92.9%，98.1%。

2.3ELISA IgM抗體法檢測結果

風疹病毒陽性孕婦血清標本126例，123例被檢出陽性，3例假陰性；女性健康查體者107例，93例被檢出陰性，14例假陽性。以細胞培養(yǎng)法作為金標準，ELISA IgM抗體法的敏感度和特異度分別為97.6%，86.9%。

2.4實時熒光RT-PCR法與ELISA IgM抗體法兩種方法特異度和敏感度比較

實時熒光RT-PCR與ELISA IgM抗體法兩種方法特異度和敏感度，見表1。

表1 比較實時熒光RT-PCR法與ELISA IgM抗體法特異度和敏感度

檢測方法 特異度敏感度 實時熒光RT-PCR法98.1% 92.9%ELISA IgM抗體法86.9%97.6%

兩種方法敏感度進行比較，u=1.75<1.96，p>0.05，因而，實時熒光RT-PCR與ELISA IgM抗體法兩種方法敏感度無統計學意義上的差異。兩種方法特異度進行比較，u=3.11>2.58，p<0.01，因而，實時熒光RT-PCR的特異度明顯高于ELISA IgM抗體法的特異度。

3 討 論

目前檢測風疹多采用ELISA法測定患者血清中的特異性風疹IgM抗體，該方法快速、靈敏，但容易引起假陽性反應。近年出現的實時熒光定量PCR技術，通過TaqMan探針雜交提高了特異性，引進光譜技術進行準確定量，避免了交叉污染，使其成為基礎研究和分子生物學診斷領域最熱門的診斷技術之一[2]。Johanna采用實時熒光定量RT-PCR檢測MMR疫苗病毒顆粒，證明其特異度與金標準-細胞培養(yǎng)法相似[3]。Chen等建立的實時熒光定量RT-PCR診斷SARS-CoV 感染，其敏感度和特異度均非常高[4]。

本研究采用實時熒光定量RT-PCR檢測孕婦血清風疹病毒RNA，并與ELISA法比較其敏感度與特異度，實驗證明，兩種方法的敏感度無顯著性差異，實時熒光定量RT-PCR的特異度明顯高于ELISA法。

實時熒光定量PCR方法彌補了常規(guī)PCR易產生假陽性和不能定量兩大技術缺陷。將其運用于RV感染的早期臨床診斷，可以最大限度地減少死胎、畸胎等的發(fā)生率。由此可見，風疹病毒RNA TaqMan實時熒光定量RT-PCR是一種簡便、快速、高特異性、高敏感性及定量準確的檢測方法，在臨床風疹早期診斷中具有很大的應用潛力。

致謝：本研究得到了中山醫(yī)科大學達安基因公司的大力協助，在此表示衷心的感謝！

[1] Edlich RF, Winters KL, Long WB 3rd, Gubler KD. Rubella and congenital rubella( German measles). [J] Long Term Eff Med Implants 2005; 15(3): 319-328.

[2] Klein D. Quantification using real-time PCR technology: applications and limitations.TRENDS in Molecular Medicine, 2002;8(6):257-260.

[3] Johanna A C， Schalk , Christa van den Elzen ,et al. Estimation of the number of infectious measles viruses in live virus vaccines using quantitative real-time PCR[J]. J Virol Methods, 2004 ,117(2):179-187.

[4] Chen W, Xu Z, Mu J, et al. Real-time quantitative fluorescent reverse transcriptase-PCR for detection of severe acute respiratory syndrome-associated coronavirus RNA[J]. Molecular Diagnosis, 2004;8(4):231-235.