姚 慧， 董 元， 劉海杰， 鐘亞婷

(沈陽化工大學(xué)應(yīng)用化學(xué)學(xué)院，遼寧沈陽110142)

電化學(xué)生物傳感器具有靈敏度高，易微型化，能在復(fù)雜體系樣品中進(jìn)行檢測等優(yōu)勢，并且所需的儀器簡單、便宜，在商業(yè)化應(yīng)用領(lǐng)域中也處于重要地位，已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)療保健、食品工業(yè)、農(nóng)業(yè)、環(huán)境等領(lǐng)域［1］.基于氧化還原蛋白質(zhì)在電極上直接電子轉(zhuǎn)移的第三代電化學(xué)生物傳感器是目前電化學(xué)生物傳感器研究的新方向，它不但在了解生物氧化還原過程的動(dòng)力學(xué)和熱力學(xué)、探索生命體內(nèi)生理作用機(jī)制等理論研究方面具有重要意義，在選擇性、靈敏度和測量范圍等性能方面也有新的突破［2］.

自從1991年碳納米管出現(xiàn)以來，因其獨(dú)特的電子學(xué)和物理化學(xué)性質(zhì)，已經(jīng)被人們廣泛地應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域［3－5］，特別是在電分析化學(xué)領(lǐng)域，其研究非常廣泛［6－8］.在生物電化學(xué)領(lǐng)域，碳納米管作為固定生物分子的載體更是倍受人們的關(guān)注，這是因?yàn)槎啾谔技{米管能支持快速的電子遷移，且可直接固定在基底電極上［9－11］.在生物電化學(xué)的研究中，已經(jīng)有將生物分子酶共價(jià)固定在碳納米管載體上的報(bào)道［7，12－13］.辣根過氧化物酶(HRP)在室溫下很穩(wěn)定，且容易得到，價(jià)格便宜，是商品化較早、應(yīng)用較為廣泛的一種酶制劑.隨著酶固定化技術(shù)的發(fā)展和新檢測方法的應(yīng)用，HRP修飾電極的檢測性能不斷提高，應(yīng)用領(lǐng)域也不斷拓展，HRP已被廣泛地應(yīng)用于酶聯(lián)免疫分析和生物傳感器的構(gòu)筑［14－15］.

以往應(yīng)用殼聚糖(CHIT)和多壁碳納米管(MWNTs)包埋HRP時(shí)，采取簡單混合的方法，制備的生物電化學(xué)傳感器取得了相應(yīng)的電化學(xué)響應(yīng)［16－17］;但是由于修飾膜中的物質(zhì)是依靠物理吸附結(jié)合起來的，因此修飾膜的穩(wěn)定性和固定化酶的性能都有待提高.本文制備了一種復(fù)合物CHIT-MWNTs，并用該復(fù)合物包埋HRP，改進(jìn)了修飾膜的性能，取得了良好的效果.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

CHI660C型電化學(xué)工作站(上海辰華儀器公司)，實(shí)驗(yàn)采用三電極系統(tǒng);玻碳電極(內(nèi)徑3 mm)或修飾電極為工作電極，飽和甘汞電極(SCE)為參比電極，鉑絲電極為輔助電極;超聲清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司).

辣根過氧化物酶(HRP)(Sigma公司)，殼聚糖(CHIT)(脫乙酰度為92%)，多壁碳納米管(MWNTs)(北京納辰科技發(fā)展有限公司)，過氧化氫(體積分?jǐn)?shù)30%).其他試劑均為分析純.實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水.

1.2 修飾復(fù)合材料的制備

質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的CHIT溶液用0.05 mol·L－1的乙酸在加熱條件下配制.10 g·L－1的HRP溶液保存于4℃冰箱中.

根據(jù)文獻(xiàn)［14］，將10 mg的MWNTs分散在10 mL的CHIT溶液中，超聲10 min后攪拌2 h，然后逐滴加入稀氨水至分散液中pH值為8.0左右，再將混合液加熱到60℃，加入10 μL戊二醛來交聯(lián)MWNTs表面沉積的CHIT.最后離心收集CHIT-MWNTs產(chǎn)物，用稀醋酸沖洗掉吸附及未交聯(lián)的殼聚糖.將得到的CHIT-MWNTs納米復(fù)合材料重新溶解于稀醋酸溶液中，備用.

1.3 電極的制備

用砂紙將玻碳電極(GCE)表面打磨光滑，用γ-Al2O3粉末打磨至鏡面，依次用體積比為1∶1硝酸，丙酮，二次蒸餾水各超聲3 min，洗去可能的污染物.用氮?dú)獯蹈蓚溆?

將0.1 mL的CHIT-WMNTs溶液、0.2 mL的殼聚糖溶液和0.1 mL的辣根過氧化物酶溶液充分混合，加入5 μL交聯(lián)劑戊二醛混合.取5 μL此混合液滴在玻碳電極表面，涂勻，放置在4℃的冰箱中24 h使干燥，得到CHIT-MWNTs-HPR/ GCE.對照實(shí)驗(yàn)中的 CHIT-HRP/GCE、CHIT/ GCE、CHIT-MWNTs/GCE的制作程序與CHITMWNTs-HPR/GCE相似.

電極未使用時(shí)放在4℃冰箱中保存.

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

電化學(xué)實(shí)驗(yàn)在一個(gè)裝有10 mL磷酸緩沖溶液(PBS)的小燒杯中進(jìn)行，準(zhǔn)確移取10 mL緩沖溶液至小燒杯中，用CHI660C型電化學(xué)工作站在－0.8 V～0.2 V點(diǎn)位范圍內(nèi)進(jìn)行循環(huán)伏安掃描.掃描前向PBS中通氮?dú)?0 min以排除氧氣的干擾，所有實(shí)驗(yàn)操作均在氮?dú)獗Ｗo(hù)下進(jìn)行.

2 結(jié)果與討論

2.1 CHIT-MWNTs納米復(fù)合材料的電鏡表征

殼聚糖表面修飾碳納米管克服了碳納米管簡單超聲分散在殼聚糖溶液中成膜不均勻的劣勢.圖1為CHIT-MWNTs納米復(fù)合材料的SEM圖像.可以看到:CHIT-MWNTs復(fù)合物呈單一的納米管狀或小的束狀，均勻地分散在GCE表面，形成一種特殊的三維結(jié)構(gòu).殼聚糖良好的生物相容性得到保留，同時(shí)，由于得到的每一根復(fù)合納米管能被充分和容易地接近，這種形貌非常有利于保留MWNTs的優(yōu)良性質(zhì)，從而能被完全和容易地用于促進(jìn)酶的電子傳輸.

圖1 CHIT-MWNTs復(fù)合材料的掃描電鏡圖Fig.1 SEM image of chitosan surface-decorated with MWNTs

2.2 CHIT-MWNTs-HPR/GCE的電化學(xué)行為

2.2.1 CHIT-MWNTs-HPR/GCE的直接電化學(xué)行為

圖2 不同修飾電極在PBS溶液中的循環(huán)伏安圖Fig.2 CVs obtainded of different modified electrodes in PBS

2.2.2 掃速的影響

圖3是在pH=7.2的PBS溶液中，CHITMWNTs-HRP/GCE在不同掃速下的循環(huán)伏安圖.由圖3可以看出:當(dāng)掃速在0.02～0.30 V/s時(shí)，隨著掃速的增加，HRP直接電子轉(zhuǎn)移的氧化、還原峰電位幾乎不發(fā)生變化，由此可見該電極具有很好的電化學(xué)可逆性.且峰電流與掃速v之間均呈線性關(guān)系，如圖4所示.回歸方程分別為:Ipc=1.097 09×10－7+5.874 9×10－6(Ipc: A，v:V·s－1，r=0.999 83);Ipa=－3.725 98× 10－8－4.668 69×10－6v(r=0.999 63).說明HRP的電極過程受表面過程控制.隨著掃速的增大，氧化峰電位Epa向正方向移動(dòng)，還原峰電位Epc向負(fù)方向移動(dòng)，ΔEp逐漸增加，但式量電位E0'幾乎不變.

圖3 不同掃速下CHIT-MWNTs-HRP/GCE在PBS溶液中的循環(huán)伏安圖Fig.3 CVs of GCE modified with HRP/CHIT-MWNTs composite film in PBS，CVs with different scan rate

圖4 掃速-峰電流圖Fig.4 Plot of the peak current vs scan rate

2.2.3 溶液pH值的影響

溶液的pH值與蛋白質(zhì)的直接電化學(xué)行為有很大關(guān)系.緩沖溶液的pH值對于HRP/CHITMWNTs修飾電極峰電位的影響如圖5所示.

隨著溶液pH的增大，HRP在CHIT-MWNTs修飾電極上氧化還原電位、式量電位均向負(fù)方向移動(dòng).這表明在HRP Fe3+/Fe2+之間發(fā)生電子轉(zhuǎn)移的同時(shí)，伴隨有質(zhì)子的轉(zhuǎn)移.此外，在pH值為3～10區(qū)間內(nèi)，循環(huán)伏安曲線上的峰電位和峰電流的變化都是可逆的.如在 pH值為7.0時(shí)，HRP/CHIT-MWNTs膜修飾電極的循環(huán)伏安行為在經(jīng)過將電極浸入pH=10.0的緩沖溶液中后重新置入pH=7.0的緩沖液中這一過程后是可重現(xiàn)的，這表明CHIT-MWNTs膜能較好地保護(hù)HRP的生物活性.

圖5 CHIT-MWNTs-HRP/GCE在不同pH值的PBS溶液中的循環(huán)伏安圖Fig.5 CVs of GCE modified with HRP/CHIT-MWNTs composite film in PBS at different pH values

2.2.4 CHIT-MWNTs-HRP/GCE對H2O2的電催化作用

為考察CHIT-MWNTs復(fù)合材料中HRP的生物電催化活性，利用循環(huán)伏安法研究CHITMWNTs-HRP/GCE對H2O2還原反應(yīng)的影響.如圖6所示，在pH=7.2的 PBS溶液中，CHITMWNTs-HRP/GCE產(chǎn)生了一對準(zhǔn)可逆的氧化還原峰，隨著H2O2的不斷加入，其循環(huán)伏安圖上氧化峰電流明顯減小，而還原峰電流明顯增加，這說明CHIT-MWNTs復(fù)合材料有效地保持了HRP對H2O2的生物電催化活性.圖6中b～k是在不同濃度的 H2O2-PBS溶液中 CHITMWNTs-HRP/GCE產(chǎn)生的循環(huán)伏安曲線.

圖6 CHIT-MWNTs-HRP/GCE在PBS溶液中分別加入H2O2的循環(huán)伏安圖Fig.6 CVs of GCE modified with HRP/CHIT-MWNTs composite film in PBS

由圖6可見，當(dāng)H2O2濃度在2.5×10－5～1.25×10－4mol·L－1范圍內(nèi)時(shí)，催化電流與H2O2濃度之間呈線性關(guān)系(見圖7)，線性回歸方程為:Ipc=6.368×10－8c+6.368×10－8(r= 0.99761，n=5)，其中 c為 H2O2濃度(單位mol·L－1)，Ipc為還原峰電流(單位A).

圖7 在PBS溶液中c(H2O2)與峰電位為－0.4 V處電流的線性關(guān)系圖Fig.7 Plot of the current vs the concentration of hydrogen peroxide

其中，Iss代表一定底物濃度下傳感器的穩(wěn)態(tài)相應(yīng)電流;Imax代表底物飽和條件下測得的最大穩(wěn)態(tài)電流;c為底物濃度.在一定范圍內(nèi)用圖7工作曲線中的數(shù)據(jù)作1/Iss～1/c圖，得到一條直線，根據(jù)該直線的斜率和截距求得=3.1×10－5mol·L－1.越小，表明酶與底物的親和力越大，酶的活性受抑制的程度越小.較小的Kappm說明CHIT-MWNTs-HRP/GCE對H2O2有較高的催化能力.同時(shí)，對CHIT-MWNTs-HPR/GCE的穩(wěn)定性進(jìn)行測試，將前述修飾電極在4℃下保存7 d后在相同條件下進(jìn)行循環(huán)伏安掃描，電流沒有明顯變化，保存30 d后峰電流僅降低至89%，可見此修飾電極具有良好的穩(wěn)定性.

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)成功地將一種新型的殼聚糖表面修飾多壁碳納米管復(fù)合材料應(yīng)用于研究蛋白質(zhì)的直接電子轉(zhuǎn)移，得出以下結(jié)論:

(1)合成的CHIT-MWNTs能在電極表面形成三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的修飾膜，為HRP提供一個(gè)合適的仿生微環(huán)境，極大地促進(jìn)了HRP與電極之間的電子轉(zhuǎn)移.

(2)通過掃速和pH值對固定化HRP直接電子傳遞的影響測定可知這是一個(gè)準(zhǔn)可逆的非擴(kuò)散控制的或薄層的電化學(xué)行為，在HRP中Fe3+/Fe2+之間發(fā)生電子轉(zhuǎn)移的同時(shí)，伴隨有質(zhì)子的轉(zhuǎn)移.

(3)通過對過氧化氫催化活性的測定可知HRP對于H2O2的還原具有明顯的催化作用，電流響應(yīng)信號與過氧化氫濃度在 2.5×10－5～1.25×10－4mol·L－1間成線性關(guān)系，表觀Michaelis-Menten常數(shù)為3.1×10－5mol·L－1.

(4)制備的CHIT-MWNTs-HRP復(fù)合膜修飾玻碳電極對過氧化氫有著明顯的電催化活性，不需要額外的電子介體.這種新型的CHIT-MWNTs復(fù)合膜為電化學(xué)生物傳感的研究提供了一個(gè)優(yōu)良的平臺.

［1］ Dai Z，Liu S，Ju H，et al.Direct Electron Transfer and Eenzymatic Activity of Hemoglobin in a Hexagonal Mesoporous Silica Matrix［J］.Biosens Bioelectron，2004，19(8):861－867.

［2］ 張謙.基于納米材料和氧化還原蛋白質(zhì)的生物復(fù)合材料的組裝和應(yīng)用［D］.合肥:中國科技大學(xué)，2007:3－5.

［3］ 成會明.納米碳管的制備、結(jié)構(gòu)、物性及應(yīng)用［M］.北京:北京化學(xué)工業(yè)出版社，2002:55－53.

［4］ 王姍，房喻，張穎，等.殼聚糖/CdS納米復(fù)合膜制備及其對吡啶的傳感特性［J］.物理化學(xué)學(xué)報(bào)，2003，19(6):514－518.

［5］ 譚學(xué)才，王健偉，徐健君，等.固載葡萄糖氧化酶的殼聚糖二氧化硅雜化膜的制備及表征［J］.中山大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2004，43(4):50－53.

［6］ Valentini F，Amine A，Orlanducci S，et al.Carbon Nanotube Purification:Preparation and Characterization of Carbon Nanotube Paste Electrodes［J］.Analytical Chemistry，2003，75(20):5413－5421.

［7］ Yu X，Chattopadhyay D，Galeska I，et al.Peroxidase Activity of Enzymes Bound to the Ends of Single-wall Carbon Nanotube Forest Electrodes［J］.Electrochemistry Communications，2003，5(5):408－411.

［8］ 李小蓉，權(quán)彥.碳納米管修飾電極上核黃素電化學(xué)行為的研究及其分析應(yīng)用［J］.咸陽師范學(xué)院學(xué)報(bào)，2008，23(2):43－45.

［9］ Bajpai V，Dai L，Ohashi T.Large-Scale Synthesis of Perpen-dicularly Aligned Helical Carbon Nanotubes［J］.Journal of the American Chemical Society，2004，126(16):5070－5071.

［10］Huang S，Mau Albert W H.Selective Growth of A-ligned Carbon Nanotubes on a Silver-patterned Substrate by the Silver Mirror Reaction［J］.The Journal of Physical Chemistry B，2003，107(15):3455－3458.

［11］王琨琦，馬中蘇.微過氧化物酶-11在多壁碳納米管修飾玻碳電極上的電化學(xué)［J］.長春工程學(xué)院學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2008，9(4):80－83.

［12］Guiseppi-Elie A，Lei Chenghong，Baughman Ray H.Direct Electron Transfer of Glucose Oxidase on Carbon Nanotubes［J］.Nanotechnology，2002，13(5): 559－564.

［13］Justin J Gooding，Wibowo Rahmat，Liu Jingquan，et al.Protein Electrochemistry Using Aligned Carbon Nanotube Arrays［J］.Journal of the American Chemical Society，2003，125(30):9006－9007.

［14］楊平華.碳納米管復(fù)合材料修飾電極的制備及其分析應(yīng)用研究［M］.長沙:湖南大學(xué)出版社，2007: 162－165.

［15］張曉蕾，吳朝陽，許銀玉，等.基于碳納米管/殼聚糖/納米金活性界面的辣根過氧化物酶傳感器研制［J］.化學(xué)傳感器，2006，26(3):12－17.

［16］張亞，張宏芳，鄭建斌.辣根過氧化物酶修飾電極在離子液體［EMIM］BF4中的直接電化學(xué)［J］.化學(xué)學(xué)報(bào)，2008，66(19):2124－2130.

［17］王曉燕，姜慧君.辣根過氧化物酶在多壁碳納米管-殼聚糖膜中的電化學(xué)和生物傳感性質(zhì)［J］.功能材料與器件學(xué)報(bào)，2008，14(6):1035－1038.