林樂勛，趙文然，武帥欽，佟雷，王燕，張鳳民，鐘照華

1. 哈爾濱醫(yī)科大學(xué)病原生物學(xué)實驗教學(xué)中心，哈爾濱 150081； 2. 哈爾濱醫(yī)科大學(xué)微生物學(xué)教研室，黑龍江省感染與免疫重點實驗室，哈爾濱 150081； 3. 哈爾濱醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞生物學(xué)教研室，哈爾濱 150081

H9c2細(xì)胞是來源于胚胎期BD1X大鼠心臟組織的亞克隆細(xì)胞系，表現(xiàn)很多骨骼肌細(xì)胞的特性[1]。當(dāng)H9c2細(xì)胞匯合時，細(xì)胞就會融合成多核的肌管并對乙酰膽堿刺激有反應(yīng)，但該細(xì)胞缺少像心肌細(xì)胞一樣的節(jié)律性搏動；此外，多項生化、電生理指標(biāo)的檢測也表明其具有骨骼肌的很多特點[1]。由于來源于心臟，H9c2細(xì)胞作為心臟成肌細(xì)胞也用于心肌疾病的研究[2,3]。

B組柯薩奇病毒(group B Coxsackievirus，CVB)是病毒性心肌炎和心肌病的主要病原體[4]。CVB可在容許細(xì)胞中迅速復(fù)制，并通過殺傷宿主細(xì)胞釋放出來。H9c2細(xì)胞能否被CVB感染，并作為體外細(xì)胞模型應(yīng)用于CVB致心肌疾病的研究，目前未見報道。本研究采用整合了增強型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP)或海腎熒光素酶(Renillaluciferase，RLuc)的CVB3重組株EGFP-CVB3、RLuc-CVB3攻擊H9c2細(xì)胞及小、大鼠原代心肌細(xì)胞和骨骼肌細(xì)胞，觀察H9c2細(xì)胞對CVB3的易感性。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物BALB/c乳鼠、Sprague-Dawley (SD)大鼠(出生4 d內(nèi))，均購自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。

1.1.2細(xì)胞、病毒H9c2和 HeLa細(xì)胞購自美國ATCC；CVB3H3為哈爾濱醫(yī)科大學(xué)微生物學(xué)教研室保存，EGFP-CVB3和RLuc-CVB3由本課題組構(gòu)建[5]并保存。

1.1.3主要試劑細(xì)胞培養(yǎng)液為DMEM，pH 7.2～7.4，使用時加入10%胎牛血清(fetal calf serum，F(xiàn)CS)和1%雙抗。消化液為0.25%胰蛋白酶及0.5%胰蛋白酶與0.04% EDTA的混合液(1∶1)。TRIzol試劑購自美國Invitrogen公司；RLU檢測試劑盒(RenillaLuciferase Assay System)E2820購自Promega公司；SYBR?PrimeScriptTMRT-PCR KitⅡ試劑盒DRR083A購自TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1H9c2細(xì)胞培養(yǎng)按常規(guī)貼壁細(xì)胞培養(yǎng)方法進行培養(yǎng)，2～3 d傳代1次。

1.2.2原代骨骼肌細(xì)胞或心肌細(xì)胞培養(yǎng)處死出生4 d內(nèi)的BALB/c乳鼠或SD乳鼠，分別取四肢肌肉和心臟，用37 ℃預(yù)溫的D-Hanks液洗1～2次，剪成體積為1 mm3的小塊；用0.25%胰酶37 ℃水浴消化10 min，將消化的細(xì)胞懸液吸出，加入含有15% FCS和1% 雙抗的DMEM 終止消化，4 ℃保存；如此循環(huán)5～7次，至組織塊完全消化。將收集好的骨骼肌細(xì)胞 1 500 r/min 離心7 min，棄上清液，用培養(yǎng)液重懸、過濾后收集細(xì)胞到培養(yǎng)瓶中或接種到孔板中，置37 ℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)。

1.2.3CVB3H3、EGFP-CVB3和RLuc-CVB3毒力測定采用空斑形成試驗測定各毒株毒力，接種于HeLa細(xì)胞，純化、擴增病毒。

1.2.4EGFP-CVB3和RLuc-CVB3感染H9c2細(xì)胞、HeLa細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞和心肌細(xì)胞當(dāng)細(xì)胞長至60%～70%時，棄培養(yǎng)液，將稀釋好的1個感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection, MOI)的病毒接種到細(xì)胞中，37 ℃、5% CO2孵箱中孵育1 h；棄病毒液后，加入適量培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.5綠色熒光觀察及流式細(xì)胞計數(shù)檢測每天用熒光顯微鏡觀察感染的各種細(xì)胞中EGFP表達(dá)情況，并用500 μl感染或未感染EGFP-CVB3的HeLa或H9c2細(xì)胞(約1×106個細(xì)胞)進行流式細(xì)胞計數(shù)，分析感染后表達(dá)EGFP的細(xì)胞數(shù)。分離的細(xì)胞采用2%聚合甲醛進行固定。通過FC 500MPL流式細(xì)胞儀(Beckman，USA)計數(shù)10 000個細(xì)胞進行分析，數(shù)據(jù)用CellQuestTMPro(BD Biosciences, USA)進行處理。

1.2.6RLuc表達(dá)水平檢測以未感染的H9c2細(xì)胞和HeLa細(xì)胞為對照，按照RLU檢測試劑盒試劑說明書，用20/20n光度計對RLuc-CVB3感染的H9c2細(xì)胞和HeLa細(xì)胞進行RLuc測定。

1.2.7病毒核酸的反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)檢測RLuc-CVB3感染H9c2細(xì)胞后，用TRIzol試劑提取培養(yǎng)在6孔板中的細(xì)胞總RNA，并針對CVB3 5′非編碼區(qū)(untranslated region，UTR)進行反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcriptase-polymerase chain reaction，RT-PCR)[6]。擴增CVB3的上、下游引物分別為：GACTTGATCCC-ACCCACAGGGCCTAT和GACGCTCTATTA-GACACCGGATGGCC，擴增片段大小為638 bp；擴增β-actin的上、下游引物分別為：AGGGAAA-TCGTGCGTGAC和CTGGAAGGTGGACAGT-GAG，擴增片段大小為444 bp。在0.2 ml微量離心管中加入反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系：下游引物(5′ UTR或β-actin)1.0 μl，RNA模板1.0 μl，5×Prime Script Buffer 2.0 μl，DEPC處理的ddH2O 5.5 μl，Prime Script RT Enzyme MixⅠ0.5 μl，總體積為10 μl。放入PCR儀中37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃終止反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系：模板0.5 μl(50 ng)，10 μmol/L上、下游引物各1.0 μl，2.5 mmol/L dNTP混合物4.0 μl，10× LA PCR BufferⅡ(含Mg2+)5.0 μl，LATaqDNA 聚合酶(5 u/μl)0.5 μl，ddH2O 38 μl。反應(yīng)條件為：95 ℃ 預(yù)變性5 min；95 ℃變性45 s，50 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)30次；72 ℃充分延伸8 min。

2 結(jié)果

2.1 CVB3H3、 EGFP-CVB3和RLuc-CVB3感染的結(jié)果

空斑形成試驗測定CVB3H3和重組病毒株EGFP-CVB3、RLuc-CVB3的毒力，結(jié)果分別為2×108pfu/ml、1.17×108pfu/ml 和1.4×107pfu/ml。兩重組株均具有較強的毒力，但由于插入外源基因片段的大小不同，毒力略低于原型株。易感的HeLa細(xì)胞被感染時可見明顯的細(xì)胞病變效應(yīng)，即細(xì)胞皺縮、變圓、聚集、脫落，甚至死亡(圖1)。

2.2 EGFP-CVB3感染后EGFP的檢測

以MOI=1的EGFP-CVB3進行攻擊，用熒光顯微鏡觀察。結(jié)果顯示，與其他細(xì)胞相比，H9c2細(xì)胞EGFP產(chǎn)生情況與原代大鼠骨骼肌細(xì)胞相似，即在感染后2～5 d原代大鼠骨骼肌細(xì)胞和H9c2細(xì)胞中均未見EGFP；與正常對照組相比，細(xì)胞正常生長，未見細(xì)胞病變效應(yīng)。而在原代小鼠心肌細(xì)胞、小鼠骨骼肌細(xì)胞和大鼠心肌細(xì)胞中都可見EGFP；與正常對照組細(xì)胞相比，產(chǎn)生EGFP的細(xì)胞部分出現(xiàn)皺縮、變圓等細(xì)胞病變效應(yīng)(圖2)。

HeLa cells were challenged with CVB3H3, EGFP-CVB3, and RLuc-CVB3 (MOI=1). The cytopathic effect was observed under light microscope at 24 h post-infection. A: HeLa cells. B: HeLa cells infected with CVB3H3. C: HeLa cells infected with EGFP-CVB3. D: HeLa cells infected with RLuc-CVB3.

圖1CVB3H3、EGFP-CVB3和RLuc-CVB3感染HeLa細(xì)胞的結(jié)果

Fig.1ResultsofHeLacellsinfectedwithCVB3H3,EGFP-CVB3,andRLuc-CVB3

Primary culture of cardiac myocytes of BALB/c mouse (mCM) and SD rat (rCM), skeletal myocytes of BALB/c mouse (mSM) and SD rat (rSM) as well as H9c2 cells were challenged with EGFP-CVB3 (MOI=1). EGFP expression was observed under 488 nm excitation at 2 to 5 d post-infection. LM, light microscopy; FM, fluorescent microscopy; NC, normal cells; VC, cells infected with EGFP-CVB3.

圖2EGFP-CVB3感染各種細(xì)胞后2～5d熒光觀察結(jié)果

Fig.2EGFPexpressioninvariouscellsinfectedwithEGFP-CVB3(MOI=1)at2to5dpost-infection

以未感染的H9c2和HeLa細(xì)胞為對照，流式細(xì)胞儀計數(shù)以MOI=1的EGFP-CVB3攻擊后感染細(xì)胞表達(dá)EGFP的細(xì)胞數(shù)。結(jié)果表明，感染的H9c2和HeLa細(xì)胞熒光(fluorescence light，F(xiàn)L)/邊散射(side scatter，SS)的模式完全不同(圖3A)。同時熒光顯微鏡下可見病毒感染的HeLa細(xì)胞出現(xiàn)明顯皺縮、變圓、脫落等細(xì)胞病變效應(yīng)，病變細(xì)胞產(chǎn)生綠色熒光；而病毒感染的H9c2細(xì)胞與正常H9c2細(xì)胞相比，形態(tài)并無明顯差別，感染后7 d也未見細(xì)胞病變效應(yīng)及特異的綠色熒光(圖3B)。

2.3 RLuc-CVB3感染后RLuc的檢測

將MOI=1的RLuc-CVB3感染H9c2細(xì)胞和HeLa細(xì)胞，間隔1 d或2 d進行RLuc檢測(n=4)。結(jié)果表明，與感染的HeLa細(xì)胞相比，感染的H9c2細(xì)胞保持較低水平的RLuc表達(dá)，直至感染后第14 天(圖4)。

To compare the green fluorescence in H9c2 cells and HeLa cells infected with EGFP-CVB3, 70% confluent H9c2 cells and HeLa cells were infected with EGFP-CVB3 (MOI=1). The cells were counted by flow cytometry and fluorescent microscopy at intervals of 2 to 3 d. HeLa cells were checked only for 2 d because the cells were killed thereafter. The X-axis represents fluorescence light (FL) in Log. The Y-axis represents side scatter (SS). The patterns of FL/SS were completely different between H9c2 cells and HeLa cells. A: Flow cytometry. B: Fluorescent microscopy. p.i., post-infection.

圖3EGFP-CVB3感染的H9c2和HeLa細(xì)胞中綠色熒光比較

Fig.3ComparisonofthegreenfluorescenceinH9c2cellsandHeLacellsinfectedwithEGFP-CVB3byflowcytometry

70% confluent H9c2 and HeLa cells were infected with RLuc-CVB3 (MOI=1). The luciferase activities were checked at intervals of 1-2 d (n=4). The infected HeLa cells were killed at the 3rd day post-infection. The luciferase activities in infected H9c2 cultures kept low at all time points tested. The Y-axis represents luciferase activity in Log.

圖4RLuc-CVB3感染的H9c2細(xì)胞中RLuc表達(dá)

Fig.4ExpressionofRLucinH9c2cellsinfectedwithRLuc-CVB3

2.4 RLuc-CVB3感染后病毒核酸的RT-PCR檢測

將MOI=1的RLuc-CVB3感染H9c2和HeLa細(xì)胞，以β-actin為內(nèi)參，用RT-PCR方法檢測H9c2細(xì)胞中RLuc-CVB3基因組RNA表達(dá)水平。結(jié)果表明，在感染后的第1、2、3、5天， H9c2細(xì)胞中可檢測到病毒RNA，而在第9天和第14天卻未檢測到(圖5)。

3 討論

H9c2細(xì)胞是來源于胚胎期的BD1X大鼠心臟組織的亞克隆細(xì)胞系，表現(xiàn)很多骨骼肌細(xì)胞的特性[1]。由于來源于心臟，H9c2細(xì)胞作為心臟成肌細(xì)胞也應(yīng)用于一些研究中[2,3]。

柯薩奇病毒屬小核糖核酸病毒科，它是小的無包膜病毒，核酸為單股正鏈RNA。根據(jù)柯薩奇病毒對乳鼠致病特點的不同，將其分成A組和B組。因為在心肌炎和擴張型心肌病患者的心肌組織中經(jīng)?？蓹z測到CVB基因組，所以認(rèn)為CVB是造成心肌炎和擴張型心肌病的主要病原體[7-10]。CVB感染容許細(xì)胞后，通常會產(chǎn)生明顯的致細(xì)胞病變效應(yīng)。H9c2細(xì)胞能否被CVB感染并作為體外細(xì)胞模型應(yīng)用于CVB致心肌疾病的研究，目前未見報道。

70% confluent H9c2 and HeLa cells were infected with RLuc-CVB3 (MOI=1). The genomic RNA of RLuc-CVB3 in infected H9c2 cells could be detected at days 1, 2, 3, and 5, but not at days 9 and 14. The amplification length of RLuc-CVB3 is 638 bp, the amplification length of β-actin is 444 bp, and the marker is DL2000. p.i., post-infection.

圖5RLuc-CVB3感染的H9c2細(xì)胞中病毒基因組的動態(tài)檢測結(jié)果

Fig.5DynamicdetectionofgenomicRNAofRLuc-CVB3inH9c2cellsinfectedwithRLuc-CVB3

本研究中，我們采用攜帶有EGFP、RLuc的CVB3重組株EGFP-CVB3和RLuc-CVB3感染H9c2細(xì)胞，通過檢測EGFP或RLuc的蛋白和核酸水平來反映CVB對 H9c2細(xì)胞的感染性。在EGFP-CVB3感染的H9c2細(xì)胞中，未檢測到EGFP表達(dá)(圖2、3)。RLuc-CVB3感染H9c2細(xì)胞后，每隔1～2 d檢測RLuc的表達(dá)直到感染后第14天(n=4)也未見RLuc產(chǎn)生(圖4)。對病毒感染的細(xì)胞進行RT-PCR檢測，在RLuc-CVB3感染的H9c2細(xì)胞中，病毒的基因組RNA從感染后第9天消失(圖5)。

根據(jù)H9c2細(xì)胞系表型的研究[3]，發(fā)現(xiàn)這種細(xì)胞表現(xiàn)的骨骼肌細(xì)胞特性多于心肌細(xì)胞特性。如當(dāng)培養(yǎng)的H9c2細(xì)胞匯合時，可融合形成多核的肌管并對乙酰膽堿的刺激有反應(yīng)，但缺少像心肌細(xì)胞一樣的節(jié)律性搏動；同時生化和電生理的檢測指標(biāo)也表明其具有骨骼肌特性[1]。我們的研究也表明大鼠骨骼肌細(xì)胞和H9c2細(xì)胞都抵抗CVB3重組毒株的感染，為支持H9c2細(xì)胞在對CVB感染的易感性上具有大鼠骨骼肌的表型提供了進一步的證據(jù)。因此，不能以這種傳代細(xì)胞系代替心肌細(xì)胞進行CVB致心肌疾病的研究。

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