朱凌燕，仇超，徐建青1,,4

1. 上海市(復(fù)旦大學(xué)附屬)公共衛(wèi)生臨床中心，上海 201508； 2. 溫州醫(yī)學(xué)院，溫州 325035； 3. 復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院，上海 201508； 4. 復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院教育部/衛(wèi)生部醫(yī)學(xué)分子病毒學(xué)重點實驗室，上海 200032

微小RNA(microRNA，miRNA)為一類長度21～24個核苷酸(nucleotide，nt)、內(nèi)源性的非編碼RNA分子。它們能識別靶mRNA上特異性的結(jié)合位點﹝通常位于3′非翻譯區(qū)(untranslated region，UTR)﹞，并通過不完全的堿基配對與靶mRNA結(jié)合，引起靶mRNA降解或抑制其翻譯，從而對基因進行轉(zhuǎn)錄后表達(dá)的調(diào)控[1,2]。miRNA具有廣泛的生物學(xué)功能，參與組織分化，細(xì)胞發(fā)育、凋亡，腫瘤形成等過程的調(diào)節(jié)[3]。有研究顯示，人體中大約92%的基因可能受miRNA調(diào)控[2]，miRNA在免疫系統(tǒng)中的功能受到廣泛重視。已有研究表明，miRNA在免疫系統(tǒng)的發(fā)育和免疫應(yīng)答中起著重要的作用，不僅調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫應(yīng)答的中心元件，而且參與固有免疫反應(yīng)[4]。不同于傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄因子全開或全關(guān)的調(diào)節(jié)方式，miRNA通過非常短的作用位點進行調(diào)節(jié)，在作用位點調(diào)節(jié)1個或少數(shù)幾個堿基對就能起關(guān)鍵作用，因而miRNA更適合對免疫系統(tǒng)進行精細(xì)調(diào)節(jié)和定量調(diào)節(jié)[5]。miRNA在宿主對病毒的免疫反應(yīng)、病毒的免疫逃逸等過程中發(fā)揮著重要作用，其與人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus, HIV)的相互作用過程很好地體現(xiàn)了這一點。

1 宿主基因編碼的miRNA

miRNA在病毒與宿主相互作用過程中發(fā)揮著重要作用。最近研究表明，宿主miRNA可抑制或促進病毒復(fù)制[6]。當(dāng)病毒侵入宿主后，宿主細(xì)胞表達(dá)一系列miRNA，形成自身防御體系。由于miRNA介導(dǎo)的RNA靜默不需要序列的完全互補，通常miRNA 5′端的2～8個堿基與mRNA的3′UTR互補配對即可[7]，所以1條miRNA可將多種mRNA作為靶位。因此，我們不難想象，在宿主miRNA抑制HIV表達(dá)的同時，病毒也會尋求一種方式來調(diào)節(jié)宿主miRNA的表達(dá)，以利于自身的復(fù)制。

1.1 宿主miRNA抑制HIV表達(dá)

Drosha和Dicer是miRNA成熟所必需的RNA酶。Triboulet等[8]利用小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)下調(diào)Drosha和Dicer的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)HIV-1在外周血單核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)中的復(fù)制能力增強，表明宿主miRNA可抑制HIV-1復(fù)制。進一步研究發(fā)現(xiàn)，miR-17/92的表達(dá)量在感染HIV-1的Jurkat細(xì)胞中下調(diào)，這可能是病毒主動對抗miRNA對其復(fù)制抑制的結(jié)果。miRNA-17/92是一個多順反子miRNA簇，編碼miRNA-17-(5p/3p)、miRNA-18、miRNA-19a、miRNA-19b-1、miRNA-20a和miRNA-92-1。通過序列分析，并未在病毒基因組中發(fā)現(xiàn)miRNA-17/92的結(jié)合靶位，但在P300/CBP相關(guān)因子(P300/CBP-associated factor，PCAF，一種組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶)中存在miRNA-17-5p和miRNA-20的結(jié)合位點。PCAF是Tat蛋白的輔助因子，對HIV-1基因表達(dá)有重要意義。過表達(dá)miRNA-17-5p或miRNA-20能很好地抑制HIV-1復(fù)制，抑制miRNA-17-5p或miRNA-20表達(dá)能增加PCAF表達(dá)量和病毒產(chǎn)生，說明miRNA-17-5p和miRNA-20是通過下調(diào)PCAF表達(dá)量來抑制病毒復(fù)制的。

與miRNA-17/92相似，miRNA-198也是通過作用于細(xì)胞周期蛋白T1，間接抑制HIV-1復(fù)制[9]。細(xì)胞周期蛋白T1是RNA聚合酶Ⅱ的延伸因子——正性轉(zhuǎn)錄延伸因子b(positive transcription elongation factor b， P-TEFb，真核轉(zhuǎn)錄延伸因子)的調(diào)節(jié)亞基，也是Tat調(diào)節(jié)HIV-1 長末端重復(fù)序列(long terminal repeat，LTR)所必需的。在人的單核細(xì)胞中細(xì)胞周期蛋白T1 低表達(dá)，但是當(dāng)細(xì)胞分化成巨噬細(xì)胞后表達(dá)量顯著升高。與之相對應(yīng)，在單核細(xì)胞中HIV-1的復(fù)制受抑制，而隨著細(xì)胞周期蛋白T1在巨噬細(xì)胞中表達(dá)量上升，HIV-1也能自由復(fù)制。值得注意的是，盡管細(xì)胞周期蛋白T1在單核細(xì)胞中的表達(dá)量很低，但其mRNA水平并不低，這意味著細(xì)胞周期蛋白T1是在mRNA水平受抑制的[10,11]。Sung等[9]對miRNA從單核細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞過程中表達(dá)量的變化進行了分析，并對表達(dá)量明顯下調(diào)的miRNA進行靶位預(yù)測，發(fā)現(xiàn)包括miRNA-198在內(nèi)的3條miRNA在細(xì)胞周期蛋白T1的3′UTR有結(jié)合位點。將這些miRNA的前體轉(zhuǎn)入293T細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)入miRNA-198前體的293T細(xì)胞中細(xì)胞周期蛋白T1表達(dá)量下降，而mRNA水平未發(fā)生改變，說明細(xì)胞周期蛋白T1的3′UTR可能是miRNA-198的靶序列。將該蛋白的3′UTR分割成相互有重疊的4段(U3-1、U3-2、U3-3和U3-4)，分別連接至pGL3載體，其中U3-1和U3-4表達(dá)受抑制，從而證實了該推測[9]。在單核細(xì)胞中抑制miRNA-198表達(dá)，細(xì)胞周期蛋白T1表達(dá)量上升，而過表達(dá)miRNA-198能抑制單核細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞時細(xì)胞周期蛋白T1的表達(dá)。同時，過表達(dá)miRNA-198將抑制HIV-1前病毒的表達(dá)以及HIV-1的復(fù)制[9]。因此，miRNA-198通過抑制細(xì)胞周期蛋白T1的表達(dá)行使其抑制HIV-1復(fù)制的功能。

不同于上述miRNA間接的作用方式，一些miRNA能直接以HIV-1轉(zhuǎn)錄本為靶位。Hariharan等[7]同時運用4種預(yù)測軟件對miRNA在HIV基因組中的靶位進行預(yù)測，發(fā)現(xiàn)5個宿主miRNA在HIV基因組中存在靶位(表1)，其中miRNA-29a和miRNA-29b的序列很相似，它們很可能與HIV-1的nef區(qū)結(jié)合，而結(jié)合位點的序列在HIV-1不同亞型(A、B、C、D、F和H)中都是保守的。隨后他們通過引物延伸方法檢測miRNA-29a、miRNA-29b和miRNA-29c在不同細(xì)胞系中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在HeLa細(xì)胞、PBMC中均有這些miRNA的表達(dá)，且表達(dá)水平相當(dāng)[3]。將nef靶區(qū)插入熒光素酶的3′UTR，轉(zhuǎn)入HeLa細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)熒光素酶活性下降了3倍左右，而熒光素酶RNA的含量并未發(fā)生改變，說明是在轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)生的抑制。用反義寡核苷酸抑制miRNA-29a、miRNA-29b的表達(dá)，熒光素酶的活性獲得部分恢復(fù)，抑制miRNA-29a產(chǎn)生的作用更大些。過表達(dá)miRNA-29a能抑制Nef蛋白表達(dá)和HIV-1復(fù)制。最近研究發(fā)現(xiàn)，HIV-1感染者的T細(xì)胞存在高豐度的miRNA-29a，與未感染HIV-1 的 293T細(xì)胞相比，感染細(xì)胞中miRNA-29a表達(dá)量提高20%。抑制miRNA-29a可增加HIV-1的產(chǎn)量和感染力；反之，表達(dá)miRNA-29a的類似物則抑制病毒復(fù)制[12]，這與Hariharan等的結(jié)論相符。miRNA在行使功能時與RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(RNA-induced silencing complex，RISC)結(jié)合，并在細(xì)胞質(zhì)處理小體(cytoplasmic processing body，又稱P小體)聚集。為觀察miRNA-29a在HIV-1 mRNA與RISC、P小體相互作用中的功能，Nathans等[12]將miRNA-29a野生型和突變體轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染野生型miRNA-29a的細(xì)胞中與Ago2(RISC重要組分)、RCK/p54(P小體重要組分)結(jié)合的HIV-1 gag mRNA的量均顯著高于轉(zhuǎn)染miRNA-29a突變體的細(xì)胞，說明miRNA-29a增強HIV-1 mRNA與RISC以及P小體的結(jié)合能力。同時，如果消耗P小體的結(jié)構(gòu)蛋白會破壞P小體結(jié)構(gòu)，并導(dǎo)致病毒產(chǎn)量和感染力的增加。

表1 宿主與病毒表達(dá)的miRNA的靶位(功能)

Tab.1 Targets (functions) of cellular miRNAs and virus-encoded miRNAs

miRNATarget (function)ReferencesCellular miRNAshsa-miRNA-17/92Downregulate PCAF, inhibit HIV-1 replication[8]hsa-miRNA-198Repress cyclin T1, inhibit HIV-1 expression and replication[9]hsa-miRNA-29a, bRepress Nef, inhibit HIV-1 replication[3,7]hsa-miRNA-149Vpr (predicted))[7]hsa-miRNA-378EnV (predicted))[7]hsa-miRNA-324-5pVif (predicted)[7]hsa-miRNA-28, 125b, 150, 223, 382Repress almost all HIV-1 encoded proteins, including Tat and Rev; involved in HIV latency[14,15]hsa-miRNA-155, 16, 181a, etc.Involved in the development and function of immune system[4]Virus-encoded miRNAsVmiRNA#1-5Proteins involved in signal transduction, protein synthesis, and degradation, DNA interference, etc.(predicted)[19]miRNA-TAR-3p, 5pHDAC-1-mediated repression of HIV expression; down-regu-late apoptotic genes, especially ERCC1 and IER3[18,21]HAA-miRNADownregulate IL-15, IL-2 receptor γ chain, IRAK1, and FM-RP (predicted)[26]HIV-1-miRNA-H1Induce knockdown of AATF; suppress genes encoding for Bcl-2, c-Myc, Par-4 and Dicer; downregulate miRNA-149[27]miRNA-N367HIV-1 promoter interference [29]miRNA-TAR2-3p, 5pNot verified[24]

HIV-1在靜息CD4+T細(xì)胞中潛伏是現(xiàn)有抗病毒藥物清除HIV-1的主要障礙，因為現(xiàn)有藥物只能作用于復(fù)制中的病毒[13]。因此，深入理解HIV-1如何維持潛伏對研發(fā)清除病毒庫的策略具有極為重要的意義。Huang等[14]發(fā)現(xiàn)，一些宿主miRNA與HIV-1的潛伏相關(guān)。將來自不同HIV-1毒株(NL-43、89.6、JR-CS、LAI.2和YU.2)的3′UTR插入pEGFP-C1載體上增強型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP)基因的3′UTR，發(fā)現(xiàn)帶有HIV-1 3′UTR的熒光強度低于空載體對照組，說明插入的片段很可能包含miRNA的作用靶位，且該靶位在不同毒株保守存在。將HIV-1 NL4-3序列 3′端1.9 kb片段切成6小段(A～F)，分別連接到pEGFP-C1載體，并轉(zhuǎn)染靜息CD4+T細(xì)胞，其中與B、D和F片段連接的EGFP表達(dá)量顯著下降，因此miRNA的結(jié)合位點可能就在這3個片段上。對B、D和F片段進一步分割至每個片段長40～76 nt，精確定位miRNA可能的結(jié)合位點。結(jié)合靜息CD4+T細(xì)胞和活化CD4+T細(xì)胞中miRNA芯片表達(dá)情況及miRNA結(jié)合位點的預(yù)測結(jié)果，發(fā)現(xiàn)miRNA-28、miRNA-125b、miRNA-150、miRNA-223和miRNA-382在靜息CD4+T細(xì)胞中表達(dá)量較高，且在B、D和F片段上有結(jié)合位點。用miRNA抑制劑抑制這5條miRNA的表達(dá)，結(jié)果無論是在轉(zhuǎn)染HIV-1克隆的靜息CD4+T細(xì)胞，還是在感染者來源的靜息CD4+T細(xì)胞中，HIV-1蛋白的表達(dá)量和病毒產(chǎn)量都增加。說明miRNA-28、miRNA-125b、miRNA-150、miRNA-223和miRNA-382能抑制靜息CD4+T細(xì)胞中HIV-1的復(fù)制，因而與HIV的潛伏有關(guān)。最近有研究表明，在新分離的PBMC中，抗HIV-1 miRNA(miRNA-28、miRNA-150、miRNA-223和miRNA-382)水平顯著高于單核細(xì)胞衍生的巨噬細(xì)胞。抑制這些miRNA在單核細(xì)胞中的表達(dá)可提高HIV-1的感染力，增加在巨噬細(xì)胞中的表達(dá)則抑制HIV-1的復(fù)制[15]，表明這些miRNA介導(dǎo)的固有免疫在保護單核-巨噬細(xì)胞免受HIV-1感染中發(fā)揮重要作用。

1.2 HIV感染導(dǎo)致宿主miRNA表達(dá)異常

在宿主miRNA抑制HIV表達(dá)和復(fù)制的同時，HIV采取某些方式主動抑制這些miRNA(如miRNA-17/92)。此外，HIV誘導(dǎo)某些抑制細(xì)胞基因miRNA的表達(dá)以利于自身存活。將轉(zhuǎn)染pNL4-3的HeLa細(xì)胞和對照一起進行miRNA芯片檢測，發(fā)現(xiàn)與未表達(dá)HIV的細(xì)胞相比，表達(dá)HIV的HeLa細(xì)胞中大多數(shù)miRNA是下調(diào)的，上調(diào)的miRNA極少見[6]。對感染HIV和未感染HIV的Jurkat細(xì)胞進行基因芯片分析，發(fā)現(xiàn)包括miRNA-122、miRNA-370、miRNA-373﹡和miRNA-297在內(nèi)的11個miRNA上調(diào)，其中一半miRNA只在感染細(xì)胞中檢測到[8]。對HIV感染者和正常人PBMC中的miRNA進行基因芯片分析，發(fā)現(xiàn)miRNA-329、miRNA-126﹡和miRNA-424是上調(diào)的[16]。盡管還沒有這些上調(diào)的miRNA功能的相關(guān)報道，但它們很可能是HIV誘導(dǎo)的，并可能有利于增強HIV的復(fù)制能力、感染性或存活等，當(dāng)然也不排除這些miRNA的上調(diào)是宿主主動抵抗HIV感染的結(jié)果。最近對HIV腦炎(HIV encephalitis，HIVE)的研究表明，Tat能夠解除特定miRNA的表達(dá)抑制，包括存在于主要皮質(zhì)神經(jīng)元的miRNA-128，而miRNA-128a能抑制突觸相關(guān)蛋白25 (synaptosomal-associated protein 25，SNAP25)的表達(dá)[17]。SNAP25作為可溶性N-乙基馬來酰亞胺敏感因子附著蛋白受體(solubleN-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor， SNARE)的組分之一，在突觸囊泡與質(zhì)膜融合、觸發(fā)神經(jīng)遞質(zhì)釋放過程中起重要作用[18]。HIVE是HIV-1感染的臨床表現(xiàn)，可引起神經(jīng)元損傷和功能紊亂。由于神經(jīng)元很稀少，一旦感染HIV-1后，將接觸到細(xì)胞毒素、細(xì)胞因子及Tat等。用重組體Tat1-72處理E17大鼠的胚胎皮質(zhì)神經(jīng)元后進行基因芯片檢測，發(fā)現(xiàn)6個miRNA(miRNA-374、miRNA-128a、miRNA-128b、miRNA-100、miRNA-25和 miRNA-99a)上調(diào)，其中miRNA-100、miRNA-128a和miRNA-374上調(diào)的表達(dá)量被重復(fù)驗證，說明這些由Tat上調(diào)的miRNA極有可能與疾病進程有關(guān)。

2 HIV編碼的miRNA

HIV-1被證實能抵抗治療、逃避免疫應(yīng)答、改變細(xì)胞免疫功能和避免感染細(xì)胞凋亡。病毒必須用其僅表達(dá)9個蛋白的有限基因組來完成這些功能，因此除需大量利用細(xì)胞途徑并破壞原有分子加工過程外，病毒自身基因組的miRNA也是一個操縱細(xì)胞功能的強有力工具[19]。

2.1 HIV miRNA作用于宿主細(xì)胞

Bennasser等[20]運用計算機預(yù)測，HIV-1可能編碼5個pre-miRNA，推測理論上能形成10條成熟的miRNA(VmiRNA#1～5)。將這些預(yù)測的miRNA序列與人基因組3′UTR序列數(shù)據(jù)庫進行比對，發(fā)現(xiàn)大量細(xì)胞mRNA是這些miRNA的靶位點。這些預(yù)測的靶位點與編碼蛋白激酶、離子通道、參與蛋白質(zhì)合成與降解的蛋白質(zhì)、生長因子以及DNA甲基化等的細(xì)胞基因有關(guān)。值得注意的是，VmiRNA#1和VmiRNA#5分別與隨后研究發(fā)現(xiàn)的2條反式激活應(yīng)答(transactivation response，TAR)元件來源的miRNA重疊或部分重疊，意味著其他幾條預(yù)測的VmiRNA可能也存在并參與對病毒或宿主基因的調(diào)控。

TAR為長59 nt的莖-環(huán)結(jié)構(gòu)，位于HIV-1轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物5′LTR的R區(qū)，能被Tat、P-TEFb識別和結(jié)合，以增加病毒基因的轉(zhuǎn)錄[2]。TAR RNA結(jié)合蛋白(transactivation response RNA binding protein，TRBP)是Dicer所必需的輔助蛋白，也是RISC的重要組成部分，而TAR可通過消耗TRBP而使下游的Dicer-RISC復(fù)合體缺少TRBP[21]。這可能部分解釋了為何HIV-1感染的細(xì)胞中miRNA表達(dá)量大多是下調(diào)的。TAR除通過結(jié)合TRBP調(diào)節(jié)宿主miRNA表達(dá)外，其自身也能編碼miRNA。Klase等[22]檢測到CD4+T細(xì)胞系表達(dá)Dicer，在體外條件下中觀察到Dicer能結(jié)合TAR并將其裂解，形成TAR來源的miRNA。這種miRNA存在于感染HIV-1的細(xì)胞系以及感染者來源的T細(xì)胞中，能引起組蛋白去乙?；?(histone deacetylase 1，HDAC-1)與病毒LTR結(jié)合，削弱病毒基因的表達(dá)，說明此病毒miRNA可能參與維持病毒的潛伏。隨后，Ouellet等[23]用RNA印跡、引物延伸和RNase保護實驗證明了2個TAR來源的miRNA，并將源于TAR莖左臂的miRNA命名為miRNA-TAR-5p，將源于右臂的命名為miRNA-TAR-3p，后者似乎優(yōu)先在HIV陽性細(xì)胞中聚積。有學(xué)者推測，在HIV-2也存在TAR來源的miRNA：miRNA-TAR2-5P和miRNA-TAR2-3P。已有研究發(fā)現(xiàn)了124 nt的TAR2 RNA結(jié)構(gòu)域，其很可能編碼miRNA前體。至于miRNA-TAR2的表達(dá)則有待確認(rèn)[24]。最近研究發(fā)現(xiàn)，TAR miRNA的表達(dá)能使細(xì)胞免于凋亡，并且下調(diào)參與細(xì)胞凋亡的基因，尤其是ERCC1和IER3，TAR miRNA在調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)時不影響mRNA水平[19]。由于TAR miRNA在病毒生活史各個階段均有表達(dá)，也可在潛伏感染細(xì)胞中檢測到[22]，所以TAR miRNA可通過延長感染細(xì)胞的存活時間以增加病毒的復(fù)制。

HIV反義起始啟動子(HIV antisense initiator，HIVaINR)元件來源于HIV-1 LTR區(qū)的TAR DNA，其自身能編碼蛋白。同時由于其反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物與所有HIV RNA轉(zhuǎn)錄物起始的約25個nt重疊，預(yù)示其具有調(diào)節(jié)自身基因表達(dá)的巨大潛能[25,26]。Ludwig等[26]運用M-折疊法分析HIVaINR，發(fā)現(xiàn)這種反義RNA能形成多種多樣的莖-環(huán)或發(fā)夾樣二級結(jié)構(gòu)，這些二級結(jié)構(gòu)可能是被命名為HAA-miRNA的病毒的miRNA(VmiRNA)前體。通過預(yù)測發(fā)現(xiàn)，白細(xì)胞介素15(interleukin-15，IL-15)、IL-2受體γ鏈、人脆性X智力低下蛋白(fragile X mental retardation protein，F(xiàn)MRP)和IL-1受體輔助激酶1(interleukin-1 receptor-associated kinase 1， IRAK1)是HAA-miRNA的靶位[27]。其中IL-15對T細(xì)胞的成熟、自然殺傷(natural killer，NK)細(xì)胞的發(fā)育和存活及長期記憶細(xì)胞的存活有重要意義；IL-2受體γ鏈?zhǔn)荌L-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15和IL-21受體的共性元件，該受體的異常表達(dá)導(dǎo)致嚴(yán)重的T細(xì)胞和NK細(xì)胞缺陷；IRAK1是天然免疫的一個決定性信號傳遞介質(zhì)[25]。因此，HAA-miRNA對IL-15、IL-2受體γ鏈、FMRP和IRAK1表達(dá)量的下調(diào)將對免疫系統(tǒng)造成損傷，并且有利于病毒在宿主中存活。FMRP是一種RNA結(jié)合蛋白，參與蛋白質(zhì)合成和miRNA加工。HIV可利用HAA-miRNA耗盡FMRP以解除宿主處理病毒的miRNA機制[27]。盡管尚未證實這些HAA-miRNA的存在，但可以推測它與其他病毒一樣，有利于HIV存活。與TAR來源的miRNA不同，Kaul等[28]研究發(fā)現(xiàn)，HIV-1-miRNA-H1能誘導(dǎo)拮抗凋亡轉(zhuǎn)錄因子(apoptosis antagonizing transcription factor，AATF)基因下調(diào)約80%，導(dǎo)致編碼抑制凋亡的bcl-2基因和增殖相關(guān)的c-myc基因受抑制。由于AATF可通過Dicer基因啟動子區(qū)的E2F(高等真核生物的轉(zhuǎn)錄因子)調(diào)節(jié)Dicer的表達(dá)，因此AATF下調(diào)導(dǎo)致Dicer表達(dá)量下降。同時，HIV-1-miRNA-H1還能下調(diào)以HIV-1編碼的Vpr為靶位的細(xì)胞miRNA-149，并最終啟動人單核細(xì)胞的凋亡。

2.2 HIV miRNA作用于病毒本身

HIV-1的nef基因位于病毒基因組的3′端，并與3′ LTR部分重疊，它在病毒復(fù)制初始階段高表達(dá)。Nef是一個多功能輔助蛋白，在病毒復(fù)制中起重要作用。同時由于Nef能下調(diào)CD4、CD8以及主要組織相容性復(fù)合物(major histocompatibility complex，MHC)Ⅰ類分子[25]，因此在發(fā)病機制方面起關(guān)鍵作用。幾個相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，nefRNA可能是一種調(diào)節(jié)HIV-1復(fù)制的順式調(diào)控因子，某些Nef變異體可抑制HIV-1復(fù)制[29-31]。Omoto等[32]通過研究來自持續(xù)感染HIV-1 ⅢB的MT-4 T細(xì)胞RNA發(fā)現(xiàn)，miRNA-N367可能是nef來源的抑制HIV-1復(fù)制的miRNA。miRNA-N367是一條來源于nef區(qū)的miRNA，在體外實驗中能阻斷HIV-1nef表達(dá)，在人和15-2-2 模型小鼠體內(nèi)也能抑制nef表達(dá)。與傳統(tǒng)的miRNA作用方式不同，miRNA-N367并不在轉(zhuǎn)錄后水平影響基因表達(dá)，而是通過干擾啟動子在轉(zhuǎn)錄水平起作用。將pH1-miRNA-N367、pCD-Tat以及含有HIV-1 LTR全長的Luc質(zhì)粒(pLTRSF2)或U3區(qū)負(fù)向反應(yīng)元件(negative responsive element，NRE)缺失的Luc質(zhì)粒(pLTRSF2-105)轉(zhuǎn)染Jurkat細(xì)胞，48 h后檢測Luc熒光強度，發(fā)現(xiàn)在miRNA-N367的作用下含有NRE的pLTRSF2質(zhì)粒轉(zhuǎn)錄活性下降約40%，而NRE缺失的pLTRSF2-105質(zhì)粒轉(zhuǎn)錄活性沒有顯著變化。在pHILL質(zhì)粒的Luc基因下游插入nef基因﹝pHILL(+)﹞，或反向插入nef作為陰性對照﹝pHILL(-)﹞。在不表達(dá)miRNA-N367的情況下，與轉(zhuǎn)染pLTRSF2的細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染pHILL(+)的細(xì)胞內(nèi)Luc活性降低約60%；在表達(dá)miRNA-N367的情況下，降低約80%。而轉(zhuǎn)染pHILL(-)的細(xì)胞內(nèi)Luc活性沒有顯著改變。說明miRNA-N367通過5′LTR區(qū)的NRE和3′UTR區(qū)的nef序列抑制HIV-1啟動子的活性[33]。盡管miRNA-N367起作用的精確機制有待研究，但可以推測miRNA-N367能抑制HIV-1復(fù)制，并允許持續(xù)低致病性或潛伏病毒感染。由于nef基因在HIV-2中保守存在，因此HIV-2可能通過同樣的機制在宿主中保持低調(diào)。

3 結(jié)語

HIV-1是慢病毒的一個亞類，能感染分裂和不分裂的細(xì)胞，在病毒RNA基因組反轉(zhuǎn)錄后整合到宿主染色體中。若不產(chǎn)生病毒顆粒則進入潛伏階段，此時病毒仍然存在于靜息的CD4 T細(xì)胞中，躲避宿主免疫監(jiān)督和抗病毒藥物治療。當(dāng)靜息細(xì)胞被激活，就能產(chǎn)生感染性的病毒顆粒。許多控制HIV潛伏的因子仍未知，而現(xiàn)有的大部分治療方案無法清除細(xì)胞內(nèi)潛伏病毒儲存庫。完全互補的反義miRNA抑制劑能阻斷miRNA的抑制效應(yīng)，并且在不激活細(xì)胞的情況下驅(qū)使病毒產(chǎn)生[34,35]，這對接受高效抗反轉(zhuǎn)錄病毒治療(highly active anti-retroviral therapy，HAART)的個體具有重要意義。然而，宿主miRNA與HIV的相互作用是復(fù)雜的：宿主miRNA可抑制HIV表達(dá)(如miRNA-17/92、miRNA-198和miRNA-29a等)，HIV感染也可導(dǎo)致宿主miRNA異常表達(dá)(如miRNA-122、miRNA-370和miRNA-128等)。不同miRNA調(diào)節(jié)的方式也不盡相同：以成簇或單獨或三聚體形式間接或直接作用于病毒[8,12,36]。病毒miRNA的存在及最近研究發(fā)現(xiàn)的HIV-miRNA-H1的可演化性[37]更增加了整個調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜性。因此，有必要深入研究miRNA在HIV生活史中的作用及其機制，這不僅有助于鑒定調(diào)節(jié)HIV表達(dá)的新靶標(biāo)，而且有助于建立有效的miRNA新療法。

[1] Provost P, Barat C, Plante I, Tremblay MJ. HIV-1 and the microRNA-guided silencing pathway: An intricate and multifaceted encounter [J]. Virus Res, 2006, 121(2): 107-115.

[2] Ouellet DL, Plante I, Barat C, Tremblay MJ, Provost P. Emergence of a complex relationship between HIV-1 and the microRNA pathway [J]. Methods Mol Biol, 2009, 487: 415-433.

[3] Ahluwalia JK, Khan SZ, Soni K, Rawat P, Gupta A, Hariharan M, Scaria V, Lalwani M, Pillai B, Mitra D, Brahmachari SK. Human cellular microRNA hsa-miR-29a interferes with viral nef protein expression and HIV-1 replication [J]. Retrovirology, 2008, 5: 117.

[4] Pedersen I, David M. MicroRNAs in the immune response [J]. Cytokine, 2008, 43 (3): 391-394.

[5] 鄭玉姝,趙樸,劉興友. MicroRNAs:免疫系統(tǒng)的新型調(diào)節(jié)子[J]. 細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志, 2009, 25(2): 181-183.

[6] Yeung ML, Bennasser Y, Myers TG, Jiang GJ, Benkirane M, Jeang KT. Changes in microRNA expression profiles in HIV-1-transfected human cells [J]. Retrovirology, 2005, 2: 81.

[7] Hariharan M, Scaria V, Pillai B, Brahmachari SK. Targets for human encoded microRNAs in HIV genes [J]. Biochem Biophys Res Commun, 2005, 337(4): 1214-1218.

[8] Triboulet R, Mari B, Lin YL, Chable-Bessia C, Bennasser Y, Lebrigand K, Cardinaud B, Maurin Thomas, Barbry P, Baillat V, Reynes J, Corbeau P, Jeang KT, Benkirane M. Suppression of microRNA-silencing pathway by HIV-1 during virus replication [J]. Science, 2007, 315 (5818): 1579-1582.

[9] Sung TL, Rice AP. miR-198 inhibits HIV-1 gene expression and replication in monocytes and its mechanism of action appears to involve repression of cyclin T1 [J]. PLoS Pathog, 2009, 5(1): e1000263.

[10] Liou LY, Herrmann CH, Rice AP. Transient induction of cyclin T1 during human macrophage differentiation regulates human immunodeficiency virus type 1 Tat transactivation function [J]. J Virol, 2002, 76 (21): 10579-10587.

[11] Rich EA, Chen IS, Zack JA, Leonard ML, O’Brien WA. Increased susceptibility of differentiated mononuclear phagocytes to productive infection with human immunodeficiency virus-1 (HIV-1) [J]. J Clin Invest, 1992, 89 (1): 176-183.

[12] Nathans R, Chu C, Serquina AK, Lu CC, Cao H, Rana TM. Cellular microRNA and P bodies modulate host-HIV-1 interactions [J]. Mol Cell, 2009, 34(6): 696-709.

[13] Han Y, Siliciano RF. Keeping quiet: microRNAs in HIV-1 latency. Nat Med, 2007, 13 (10):1138-1140.

[14] Huang J, Wang F, Argyris E, Chen K, Liang Z, Tian H, Huang W, Squires K, Verlinghieri G, Zhang H. Cellular microRNAs contribute to HIV-1 latency in resting primary CD4+T lymphocytes [J]. Nat Med, 2007, 13 (10): 1241-1247.

[15] Wang X, Hou W, Zhou Y, Wang YJ, Metzger DS, Ho WZ. Cellular microRNA expression correlates with susceptibility of monocytes/macrophages to HIV-1 infection [J]. Blood, 2009, 113(3): 671-674.

[16] Houzet L, Yeung ML, Lame V, Desai D, Smith SM, Jeang KT. MicroRNA profile changes in human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) seropositive individuals [J]. Retrovirology, 2008, 5: 118.

[17] Eletto D, Russo G, Passiatore G, Valle LD, Giordano A, Khalili K, Gualco E, Peruzzi F. Inhibition of SNAP25 expression by HIV-1 Tat involves the activity of miR-128a [J]. J Cell Physiol, 2008, 216(3): 764-770.

[18] Hodel A. SNAP-25 [J]. Int J Biochem Cell Biol, 1998, 30 (10): 1069-1073.

[19] Klase Z, Winograd R, Davis J, Carpio L, Hildreth R, Heydarian M, Fu S, McCaffrey T, Meiri E, Ayash-Rashkovsky M, Gilad S, Bentwich Z, Kashanchi F. HIV-1 TAR miRNA protects against apoptosis by altering cellular gene expression [J]. Retrovirology, 2009, 6: 18. doi:10.1186/1742-4690-6-18.

[20] Bennasser Y, Le SY, Yeung ML, Jeang KT. HIV-1 encoded candidate micro-RNAs and their cellular targets [J]. Retrovirology, 2004, 1: 43. doi:10.1186/1742-4690-1-43.

[21] Bennasser Y, Yeung ML, Jeang KT. HIV-1 TAR RNA subverts RNA interference in transfected cells through sequestration of TAR RNA-binding protein, TRBP*[J]. Biol Chem, 2006, 281(38): 27674-27678.

[22] Klase Z, Kale P, Winograd R, Gupta MV, Heydarian M, Berro R, McCaffrey T, Kashanchi F. HIV-1 TAR element is processed by Dicer to yield a viral micro-RNA involved in chromatin remodeling of the viral LTR [J]. BMC Mol Biol, 2007, 8: 63.

[23] Ouellet DL, Plante I, Landry P, Barat C, Janelle M, Flamand L, Tremblay MJ, Provost P. Identification of functional microRNAs released through asymmetrical processing of HIV-1 TAR element [J]. Nucl Acids Res, 2008, 36(7): 2353-2365.

[24] Purzycka KJ, Adamiak RW. The HIV-2 TAR RNA domain as a potential source of viral-encoded miRNA. A reconnaissance study [J]. Nucl Acids Symp Ser, 2008, 52(1): 511-512.

[25] Moens U. Silencing viral microRNA as a novel antiviral therapy [J] ? J Biomed Biotechnol, 2009, 2009: 419539. doi: 10.1155/2009/419539.

[26] Ludwig LB, Ambrus JL Jr, Krawczyk KA, Sharma S, Brooks S, Hsiao CB, Schwartz SA. Human immunodeficiency virus-type 1 LTR DNA contains an intrinsic gene producing antisense RNA and protein products [J]. Retrovirology, 2006, 3: 80. doi:10.1186/1742-4690-3-80.

[27] Ludwig LB. RNA silencing and HIV: a hypothesis for the etiology of the severe combined immunodeficiency induced by the virus [J]. Retrovirology, 2008, 5: 79. doi:10.1186/1742-4690-5-79.

[28] Kaul D, Ahlawat A, Gupta SD. HIV-1 genome-encoded HIV1-miR-H1 impairs cellular responses to infection [J]. Mol Cell Biochem, 2009, 323(1-2): 143-148.

[29] Yamamoto T, Omoto S, Mizuguchi M, Mizukami H, Okuyama H, Okada N, Saksena NK, Brisibe EA, Otake K, Fujii YR. Doublestranded nef RNA interferes with human immunodeficiency virus type 1 replication [J]. Microbiol Immunol, 2002, 46: (11): 809-817.

[30] D’Aloja P, Olivetta E, Bona R, Nappi F, Pedacchia D, Pugliese K, Ferrari G, Verani P, Federico M. gag, vif, and nef genes contribute to the homologous viral interference induced by a nonproducer human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) variant: identification of novel HIV-1-inhibiting viral protein mutants [J]. J Virol, 1998, 72(5): 4308-4319.

[31] Olivetta E, Pugliese K, Bona R, D’Aloja P, Ferrantelli F, Santarcangelo AC, Mattia G, Verani P, Federico M. cis expression of the F12 human immunodeficiency virus (HIV) Nef allele transforms the highly productive NL4-3 HIV type 1 to a replication defective strain: involvement of both Env gp41 and CD4 intracytoplasmic tails [J]. J Virol, 2000, 74 (1): 483-492.

[32] Omoto S, Ito M, Tsutsumi Y, Ichikawa Y, Okuyama H, Brisibe EA, Saksena NK, Fujii YR. HIV-1 nef suppression by virally encoded microRNA [J]. Retrovirology, 2004, 1: 44. doi:10.1186/1742-4690-1-44.

[33] Omoto S, Fujii YR. Regulation of human immunodeficiency virus 1 transcription by nef microRNA [J]. J Gen Virol, 2005, 86(3): 751-755.

[34] Weinberg MS, Morris KV. Are viral-encoded microRNAs mediating latent HIV-1 infection [J]. DNA Cell Biol, 2006, 25 (4): 223-231.

[35] Zhang H. Reversal of HIV-1 latency with anti-microRNA inhibitors [J]. Int J Biochem Cell Biol, 2009, 41(3): 451-454.

[36] Kanak M, Alseiari M, Balasubramanian P, Addanki K, Aggarwal M, Noorali S, Kalsum A, Mahalingam K, Pace G, Panasik N, Bagasra O. Triplex-forming microRNAs form stable complexes with HIV-1 provirus and inhibit its replication [J]. Appl Immunohistochem Mol Morphol, 2010, 18(6): 532-545.

[37] Lamers SL, Fogel GB, McGrath MS. HIV-miR-H1 evolvability during HIV pathogenesis [J]. Biosystems, 2010, 101(2): 88-96.