王晶晶，李薇，趙紅玲，劉龍丁，唐東紅, 楊麗仙, 董承紅，納銳雄，王麗春，張瑩，梁燕，廖蕓，李琦涵

1. 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院/北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所，云南省重大傳染病疫苗研發(fā)重點實驗室，昆明 650118； 2. 昆明醫(yī)學(xué)院，昆明 650032

作為小RNA病毒科腸道病毒屬的成員之一，腸道病毒71型(enterovirus 71，EV71)雖已得到深入的病原學(xué)研究[1]，但其在人群中的傳播規(guī)律尚未明確[2]。以往報道均認(rèn)為，由于EV71具有腸道病毒的生物學(xué)特性，其傳播為糞-口途徑[3,4]。但更多的流行病學(xué)及病原學(xué)研究提示，該病毒可經(jīng)食物、呼吸道或通過接觸而在人群中傳播[5]。同時，流行病學(xué)的分析基于該病毒能在人群，尤其是在感染性兒童群體，如幼兒園、小學(xué)中迅速蔓延的現(xiàn)象，提示其經(jīng)污染的空氣、飛沫而通過呼吸道及消化道傳播的可能[6]。對其他腸道病毒如脊髓灰質(zhì)炎病毒的研究顯示，腸道病毒事實上可經(jīng)消化道和呼吸道傳播，并能首先在消化道或呼吸道黏膜上皮及淋巴組織中增殖[7]。此類腸道病毒感染的個體不僅能通過糞便，亦可通過咽部分泌物排出病毒[8]。這些資料為進一步探索EV71在人群中傳播的特點奠定了基礎(chǔ)。有關(guān)EV71感染的動物學(xué)模型研究亦表明，通過不同途徑使小鼠或獼猴感染 EV71所產(chǎn)生的病理學(xué)表現(xiàn)有一定差異[9-11]。我們在前期工作中，初步建立了恒河嬰猴EV71實驗性感染模型，通過不同感染途徑的分析，提出EV71感染恒河猴亦以呼吸道途徑為主的可能機制。這些工作中的相關(guān)感染病理學(xué)、病原學(xué)分析提示，EV71可能在黏膜被單核類細胞吞噬并攜帶至頸、腋下及氣管周圍的淋巴結(jié)，以尚不清楚的機制在其中增殖，然后進入血液循環(huán)，感染外周神經(jīng)、棕色脂肪、肌肉及相關(guān)神經(jīng)組織，并在一定情況下引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染[7]。此類感染通常在恒河嬰猴肺部引起炎性反應(yīng)，表現(xiàn)為輕至中度的間質(zhì)性肺炎及支氣管炎。這樣一個基本完整的感染過程為分析EV71在恒河猴模型中的感染、傳播等機制提供了一些客觀的病理學(xué)和病原學(xué)指征[12]，如感染后動物出現(xiàn)典型的肢體、口腔黏膜皰疹，感染后3～9 d體溫升高，以及出現(xiàn)病毒血癥等；另外，咽部及糞便排毒也可作為研究該模型具有傳染能力的線索[7]?；谝陨辖Y(jié)果，本文進一步研究了EV71在恒河嬰猴感染個體向其他未感染個體傳播(次代感染)的可能性，并對這種可能性的相關(guān)生物學(xué)意義做了初步分析。

1 材料和方法

1.1 材料

使用的毒株EV71 FY-23來源于2008年5月中國阜陽地區(qū)1名臨床出現(xiàn)嚴(yán)重心肺衰竭癥狀的手足口病男性患兒的咽部分泌物，病毒液經(jīng)0.2 μm濾器過濾后接種Vero細胞(來自荷蘭RVIM研究所，保存于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所，使用代次為145～150)，收獲感染EV71的Vero細胞并連續(xù)傳代，第4代起的病毒用于實驗。Vero細胞生長于含5%小牛血清的DMEM，待細胞在T-75培養(yǎng)瓶或96孔板內(nèi)形成單層后備用。

1.2 方法

1.2.1 病毒效價測定 將收獲的病毒液按常規(guī)進行對數(shù)稀釋[13]，以100 μl/孔加于96孔平底培養(yǎng)板，每個稀釋度接種8孔，隨后按每孔1×104個細胞/100 μl培養(yǎng)液加入Vero細胞。第3、5、7天觀察并記錄病變，超過50%細胞病變的孔判為病變陽性。

1.2.2 中和抗體效價測定 恒河嬰猴逐日采血，分離血清后檢測中和抗體效價。血清樣品56 ℃滅活30 min，以2% MEM樣品稀釋液倍比稀釋，37 ℃放置1 h；按50 μl/孔加入96孔平底培養(yǎng)板，每孔的EV71細胞培養(yǎng)半數(shù)感染量(cell culture infective dose 50%，CCID50)為100，再按每孔1×104個細胞/100 μl培養(yǎng)液加入Vero細胞。同時，設(shè)血清對照組、病毒對照組、細胞對照組。每天觀察各對照組及實驗組細胞的病變情況，實驗組以不出現(xiàn)病變的最高血清稀釋度為該血清的中和抗體效價。

1.2.3 實驗用恒河嬰猴及病毒感染方法 實驗使用6只平均體重(1.0 ± 1.3)kg、平均年齡1.5個月的健康嬰猴。嬰猴均隨其母猴單籠喂養(yǎng)，按照實驗動物標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程飼養(yǎng)。在實驗開始前2周開始隔離，此時采集血樣，檢測實驗猴的EV71抗體，保證所有實驗猴在實驗前EV71抗體均為陰性。取組織培養(yǎng)制備的EV71 104.5CCID50，通過噴霧形式經(jīng)呼吸道感染2只嬰猴(A組)。于感染后7 d取A組嬰猴糞便0.5 g，重懸于1 ml磷酸緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)。經(jīng)沉淀、離心及過濾除菌處理后，取上清液0.5 ml，以噴霧形式經(jīng)呼吸道感染2只新的嬰猴(B組)。同時收集A組嬰猴糞便，處理后取上清液經(jīng)血液途徑感染2只嬰猴作為對照，并對哺乳B組嬰猴的母猴(C組)也進行全面的臨床觀察。

1.2.4 病毒感染動物的臨床觀察及臨床樣本的收集 感染后21 d內(nèi)，每天通過肛門監(jiān)測猴體溫2次，進行臨床觀察并記錄；每天取抗凝血0.3 ml、糞便0.5 g和咽拭子。

1.2.5 感染動物樣本中病毒RNA的提取 提取血液中總RNA：每天取抗凝血200 μl，加入800 μl TRNzol-A+，按天根生化科技有限公司TRNzol-A+總RNA提取試劑說明書操作。

1.2.6 實時聚合酶鏈反應(yīng)檢測病毒載量 利用EV71 FY-23株(GenBank系列號：EU812515)基因序列VP1保守區(qū)設(shè)計引物及探針：Vp1f(2 371～2 390)：5′-AGCCCAAAAGAACTTCACTA-3′；Vp1r(2 531～2 541)：5′-ATCCAGTCGATGGCT- GCTCA-3′；Probe (2 411～2 438)：5′-FAM-AGTG- ATATCCTGCAGACGGGCACCATCC-TAMRA-3′。實時聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)的反應(yīng)體系及反應(yīng)條件按TaKaRa公司 One Step PrimeScriptTMRT-PCR Kit試劑盒說明書操作。同時，將濃度分別為105、104、103、102、101、100、10-1拷貝/μl的EV71 RNA標(biāo)準(zhǔn)品加入同一反應(yīng)板中進行PCR反應(yīng)。

1.2.7 組織病理學(xué)檢查 感染后第10天，電擊將猴處死，分別采取大腦，小腦，延腦，中腦，脊髓頸、胸、腰段，心，肝，脾，肺，腎，胰，淋巴結(jié)等組織，經(jīng)固定、脫水、包埋、切片、HE 染色，觀察結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 11.0 軟件分析。

2 結(jié)果

2.1 EV71感染嬰猴與其次代感染嬰猴的臨床表現(xiàn)

結(jié)果表明，A組和B組嬰猴呈現(xiàn)相似的臨床表現(xiàn)，在感染后4～9 d出現(xiàn)肢體及口腔黏膜的皰疹性病變(圖1)、體溫升高等(表1)。值得注意的是，2組動物均未出現(xiàn)典型的神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，僅個別動物出現(xiàn)輕度可逆的肢體肌張力下降，但該表現(xiàn)缺乏明確的定量標(biāo)準(zhǔn)，這與我們先前的研究結(jié)果類似[7]。同時C組作為成年恒河猴，未觀察到明顯的臨床表現(xiàn)(表1)。

2.2 次代感染嬰猴的病毒血癥特征

檢測感染后逐日提取的B組動物血液，發(fā)現(xiàn)與EV71直接感染的A組動物類似，B組動物在感染后的第3天即出現(xiàn)明顯的病毒血癥高峰(圖2)，兩者均表現(xiàn)相似的病毒載量。結(jié)果提示，對恒河嬰猴模型而言，EV71直接感染動物引起的臨床癥狀是由于病毒在體內(nèi)相關(guān)增殖而導(dǎo)致的。結(jié)合前期的工作結(jié)果[7]，可以推斷，EV71感染的恒河嬰猴具有以排泄物形式向新的同類個體傳播的傳染病特征。有意思的是，C組動物亦在B組動物出現(xiàn)病毒血癥后期，出現(xiàn)了一個病毒拷貝數(shù)水平較低的病毒血癥峰值，提示受感染的次代嬰猴可繼續(xù)向其他個體傳播。

A: Pathological changes in vesicular lesions in hand muscle in Group A (200×). B: Pathological changes in vesicular lesions in foot muscle in Group B (200×). C: Pathological changes in vesicular lesions in oral mucosa in Group B (200×). Typical pathological changes in respiratory apparatus (hand and foot muscle) of EV71-infected rhesus monkeys, such as infiltration of inflammatory cells, perivascular cuffing, edema, and hemorrhage, are shown. Samples were collected at day 7 post-infection. Histopathological examinations were performed on 4-μm sections of paraffin-embedded tissue or organ stained with HE according to protocol.

圖1 EV71感染恒河嬰猴肢體及口腔黏膜皰疹的病理學(xué)改變

Fig.1 Pathological changes in the mouth and feet of neonatal rhesus monkeys infected with EV71

表1 EV71感染恒河猴的臨床表現(xiàn)

Tab.1 Clinical manifestation in EV71-infected rhesus monkeys

GroupMonkey IDClinical manifestationVesicular lesionsMouthHandFootBodytemperature*Muscular tensionMental statusFood intakeDiarrheaABCControl10YYY↑--+-11YNY↑+---32YNY↑----33YYY↑---+32MNNN-----33MNNN-----34YYN↑+-+-35YYY↑----

Note: Y, yes; N, no; +, abnormal; -, normal; *, the temperature was higher than normal body temperature ranging from 38 ℃ to 39 ℃.

Dynamic distribution of EV71 in infected rhesus monkey via respiratory route. The rhesus monkeys were challenged with EV71 (104.5CCID50per monkey). Viral RNA was extracted from blood specimens and measured by TaqMan-based real-time quantitative PCR.

圖2 EV71感染恒河猴的血液病毒載量

Fig.2 EV71 viral loads in the blood of infected rhesus monkeys

2.3 次代感染嬰猴的排毒特征

分析EV71原代及次代感染恒河猴的咽拭子和糞便中病毒載量，結(jié)果顯示恒河猴能通過咽部和糞便向體外排毒(圖3)，基本趨勢類似。在咽拭子檢測中，排毒高峰出現(xiàn)在感染后7～8 d，病毒載量差異不明顯(圖3A)。另外，對A組和B組動物糞便的逐日檢查表明，B組的排毒高峰時間稍延后，約在感染后第10天，但咽部和糞便排毒時間均在病毒血癥高峰之后(圖3)。結(jié)果提示，EV71感染動物出現(xiàn)的病毒血癥使其在靶器官的感染增殖成為可能，并隨后排出。有意思的是，C組動物盡管在糞便排毒峰值時間上明顯滯后于A、B組動物，但咽部排毒的峰值時間卻與B組動物相似。

A: Viral loads in throat swabs of infected rhesus monkeys. B: Viral loads in feces of infected rhesus monkeys. Throat swabs and stool specimens were collected during the whole course of EV71 infection (1-23 d ).

圖3 EV71感染恒河猴的咽拭子和糞便病毒載量

Fig.3 EV71 viral loads in the throat swabs and feces of infected rhesus monkeys

2.4 次代感染嬰猴的特異性抗體反應(yīng)

檢測次代感染動物(B組)抗EV71特異性中和抗體，發(fā)現(xiàn)該組動物在感染后7 d可見一個弱的特異性中和抗體效價上升(圖4)，抗體型別分析表明為IgM。在第14天左右出現(xiàn)第2個中和抗體效價峰值，抗體為IgG。與原代感染動物(A組)相似。呼吸道感染和血液感染途徑表現(xiàn)出類似的免疫反應(yīng)特征。C組動物僅見一個IgG的中和抗體峰值，出現(xiàn)在B組動物感染后的21 d后。

圖4 EV71感染恒河猴中和抗體效價的比較

Fig.4 Neutralizing antibody titers as induced by EV71 infection in rhesus monkeys

2.5 次代感染嬰猴的組織病理學(xué)特征

我們的前期資料表明，組織病理學(xué)檢查中，經(jīng)呼吸道感染的嬰猴可在中樞神經(jīng)系統(tǒng)見到明確的病理學(xué)變化，包括神經(jīng)細胞壞死、退行性改變、炎細胞聚集、血管套狀炎細胞聚集等；在肺部及支氣管亦觀察到以上皮細胞壞死、肺泡結(jié)構(gòu)破壞和炎細胞浸潤等為特征的間質(zhì)性肺炎病理改變[7]。為觀察次代感染動物的病理學(xué)改變，在B組的2只嬰猴中選取1只于感染后10 d處死，并按以往程序進行相應(yīng)器官病理學(xué)檢查[7]。同時，處死1只血液感染對照猴進行同樣觀察。結(jié)果表明，次代感染嬰猴中樞神經(jīng)系統(tǒng)和肺部均出現(xiàn)類似于原代感染嬰猴第10天出現(xiàn)的病理改變，其中樞神經(jīng)系統(tǒng)的病變特點亦為少量神經(jīng)細胞退行性改變、血管套狀炎細胞聚集、灰質(zhì)細胞明顯浸潤，并以腦橋和中腦為主要病變區(qū)域。同時，肺泡亦出現(xiàn)輕度間質(zhì)性肺炎表現(xiàn)，小血管周圍有炎細胞浸潤，肺泡結(jié)構(gòu)和支氣管結(jié)構(gòu)也有輕度損傷等。這些病理改變與原代感染嬰猴相比程度稍輕，其他組織未見明顯改變(表2)。

表2 EV71感染恒河嬰猴主要器官的病理改變特征

Tab.2 Pathological changes in EV71-infected neonatal rhesus monkeys

GroupCerebrumCerebellumThalamusMedulla oblongataMidbrainPonsSpinal cordHeartLungTracheaLiverPancreasSpleenA+---+++-++---B---+++++-+----Control----+++-E----

Note: Central nervous system (CNS) lesions were scored according to the evaluation of extent of pathological change in CNS. E, edema and/or hemorrhage; +, cellular infiltration; ++, cellular infiltration with minimal neural damage and tissue damage; +++, cellular infiltration with extensive neural damage and severe damage of tissue; -, no obvious pathological change.

3 討論

在病毒感染的生物學(xué)研究中，動物模型不僅應(yīng)能反映病原體感染所產(chǎn)生的臨床表現(xiàn)、病理學(xué)反應(yīng)及其相應(yīng)生理學(xué)指標(biāo)改變，還應(yīng)能反映感染個體是否具有向其他個體傳播該病原體的可能[14]，這對病原體感染的動物模型研究提出了更具體的要求。因此，在恒河嬰猴的EV71感染研究中，我們同時關(guān)注感染后嬰猴是否可繼續(xù)傳播及通過何種途徑傳播病原體的可能。當(dāng)次代個體通過呼吸道氣霧形式接受來自原代感染個體的糞便提取上清液后，可觀察到典型的病毒血癥；血中病毒檢出時間4～9 d，同時出現(xiàn)肢體及口腔黏膜的皰疹性病變、體溫升高等一系列類似手足口病的臨床癥狀。進一步觀察咽拭子及糞便病毒載量發(fā)現(xiàn)，兩者的峰值均在血液病毒高峰之后，且在中和抗體效價檢測和組織病理學(xué)檢查中均有類似的表現(xiàn)。這些結(jié)果在一定程度上表明，EV71感染的嬰猴個體可通過糞便-呼吸道途徑繼續(xù)感染新的易感個體，意味著恒河嬰猴作為EV71的感染動物模型可行。本研究證實，病毒不僅能在動物體內(nèi)完成一個感染的病理過程，還能通過該動物的糞便繼續(xù)以同樣途徑感染新的易感個體。同時，本文也進一步證實我們在前期動物實驗中觀察到的EV71通過呼吸道途徑比消化道途徑引起更有效感染的現(xiàn)象[7,15]。結(jié)合對EV71感染人群進行流行病學(xué)觀察時所明確發(fā)現(xiàn)的感染能在很短時間內(nèi)波及較大范圍內(nèi)易感者的事實[16]，我們有理由推論，EV71在易感人群中的主要傳播途徑是呼吸道。當(dāng)然，其最終證實尚需更多實驗及觀察。 另外，本研究還觀察到，雖然沒有直接給予感染，但僅接觸次代感染嬰猴的哺乳期母猴在血、咽拭子、糞便中均有一過性的病毒排出峰值，病毒載量明顯低于原代和次代感染組。這一現(xiàn)象提示，哺乳期母猴因接觸次代感染嬰猴而導(dǎo)致病毒感染，其后期特異性中和抗體的出現(xiàn)也證明該感染的發(fā)生。盡管這些哺乳期母猴并未表現(xiàn)出明顯的臨床癥狀，但我們前期針對恒河成年猴的感染性實驗結(jié)果顯示，不同途徑感染的所有動物，無論是否具有靶器官的病理改變及明顯的病毒血癥，均無明顯臨床表現(xiàn)[17]，與本文中這一現(xiàn)象相符。同時，這一現(xiàn)象從動物模型研究角度支持先前有關(guān)感染兒童的EV71可能源自無癥狀成年感染者的報道[18]。如果這一推論是合理的，則提示一種可能，即人類低齡個體和成年個體對EV71同樣敏感，而嬰幼兒成為發(fā)病主體是因為病毒與嬰幼兒發(fā)育尚不成熟的免疫系統(tǒng)相互作用，引起機體相應(yīng)病理損傷。因此，要進一步闡明EV71在兒童群體中的發(fā)病規(guī)律，還應(yīng)同時深入探索EV71在嬰幼兒體內(nèi)的具體致病機制。

[1] Yan JJ, Wang JR, Liu CC, Yang HB, Su IJ. An outbreak of enterovirus 71 infection in Taiwan 1998: a comprehensive pathological, virological, and molecular study on a case of fulminant encephalitis [J]. J Clin Virol, 2000, 17(1):13-22.

[2] McMinn PC. An overview of the evolution of enterovirus 71 and its clinical and public health significance [J]. FEMS Microbiol Rev, 2002 ,26(1): 91-107.

[3] Shah VA, Chong CY, Chan KP, Ng W, Ling AE. Clinical characteristics of an outbreak of hand, foot and mouth disease in Singapore [J]. Ann Acad Med Singapore, 2003, 32(3): 381-3817.

[4] Solomon T, Lewthwaite P, Perera D, Cardosa MJ, McMinn P, Ooi MH. Virology, epidemiology, pathogenesis, and control of enterovirus 71 [J]. Lancet Infect Dis, 10(11): 778-790.

[5] Lin TY, Chang LY, Hsia SH, Huang YC, Chiu CH, Hsueh C. The 1998 enterovirus 71 outbreak in Taiwan: pathogenesis and management [J]. Clin Infect Dis, 2002, 34(2): 52-57.

[6] Chang LY, King CC, Hsu KH, Ning HC, Tsao KC, Li CC. Risk factors of enterovirus 71 infection and associated hand, foot, and mouth disease herpangina in children during an epidemic in Taiwan [J]. Pediatrics, 2002, 109(6): 88-91.

[7] Liu L ZH, Zhang Y, Wang J, Che Y, Dong C, Zhang X, Na R, Shi H, Jiang L, Wang L, Xie Z, Cui P, Li Q. Neonatal rhesus monkey is a potential animal model for studying pathogenesis of EV71 infection [J]. Virology, 2011, 412(1):91-100.

[8] Chang LY TK, Hisa AH, Shih SR, Huang CG, Chan WK, Hsu, KH, Fang TY, Huang YC, Lin TY. Transmission and clinical features of enterovirus 71 infections in household contacts in Taiwan [J]. J Am Med Assoc, 2004, 291 (2):222-227.

[9] Arita M, Shimizu H, Nagata N, Ami Y, Suzaki Y, Sata T. Temperature-sensitive mutants of enterovirus 71 show attenuation in cynomolgus monkeys [J]. J Gen Virol, 2005, 86(5): 1391-1401.

[10] Arita M, Nagata N, Iwata N, Ami Y, Suzaki Y, Mizuta K. An attenuated strain of enterovirus 71 belonging to genotype a showed a broad spectrum of antigenicity with attenuated neurovirulence in cynomolgus monkeys [J]. J Virol, 2007, 81(17): 9386-9395.

[11] Nagata N, Iwasaki T, Ami Y, Tano Y, Harashima A, Suzaki Y. Differential localization of neurons susceptible to enterovirus 71 and poliovirus type 1 in the central nervous system of cynomolgus monkeys after intravenous inoculation [J]. J Gen Virol, 2004, 85(10): 2981-2989.

[12] 王晶晶，趙紅鈴，張瑩，劉龍丁，王麗春，廖蕓，董承紅，納銳雄，張雪梅，李琦涵. 腸道病毒71型滅活疫苗免疫恒河猴在攻毒實驗中的感染動力學(xué)[J]. 微生物與感染, 2010, 5(4): 200-207.

[13] 中國生物制品標(biāo)準(zhǔn)化委員會. 中國生物制品規(guī)程[S]. 2000.

[14] Nagata N, Shimizu H, Ami Y, Tano Y, Harashima A, Suzaki Y. Pyramidal and extrapyramidal involvement in experimental infection of cynomolgus monkeys with enterovirus 71 [J]. J Med Virol, 2002, 67(2): 207-216.

[15] Wang YF, Chou CT, Lei HY, Liu CC, Wang SM, Yan JJ. A mouse-adapted enterovirus 71 strain causes neurological disease in mice after oral infection [J]. J Virol, 2004, 78(15): 7916-7924.

[16] Wang SM, Liu CC. Enterovirus 71: epidemiology, pathogenesis and management [J]. Expert Rev Anti Infect Ther, 2009, 7(6): 735-742.

[17] Zhang Y, CW, Liu L, Wang J, Zhao H, Liao Y, Na R, Dong C, Wang L, Xie Z, Gao J, Cui P, Zhang X, Li Q. Pathogenesis study of enterovirus 71 infection in rhesus monkeys [J]. Lab Invest, 2011, 91(9): 1337-1350.

[18] Zhang HM, Li CR, Liu YJ, Liu WL, Fu D, Xu LM. To investigate pathogen of hand, foot and mouth disease in Shenzhen in 2008 [J]. Zhonghua Shi Yan He Lin Chuang Bing Du Xue Za Zhi, 2009, 23(5): 334-336.