席國(guó)萍，宋國(guó)斌

（山西大同大學(xué)醫(yī)學(xué)院，山西大同 037009）

大孔吸附樹脂分離純化黃連小檗堿研究

席國(guó)萍，宋國(guó)斌

（山西大同大學(xué)醫(yī)學(xué)院，山西大同 037009）

目的：篩選適用于分離純化黃連小檗堿的大孔吸附樹脂。方法：本文考察了10種大孔吸附樹脂，篩選出了適用于分離純化黃連小檗堿的D101大孔吸附樹脂，其靜態(tài)吸附量為18.08 mg/g，靜態(tài)和動(dòng)態(tài)解吸率均為95%以上。結(jié)果：選用D101大孔吸附樹脂，先水洗除雜，再用4～5倍樹脂體積的60%乙醇洗脫，濃縮干燥，產(chǎn)品中小檗堿的含量為30.02%，產(chǎn)品收率為9.12%。結(jié)論：本法簡(jiǎn)單、易行，適合黃連小檗堿的提取。

黃連；小檗堿；分離；純化

黃連為毛茛科多年生草本植物，主要分布于川、黔、滇、鄂等省高寒陰暗潮濕的局部山區(qū)，為我國(guó)西南部著名的中藥材[1]。黃連根莖主要含有小檗堿，其次為黃連堿、甲基黃連堿、藥根堿等，由于結(jié)構(gòu)相似，統(tǒng)稱為黃連生物堿[2]。小檗堿有明顯抗心律失常、降血糖、抗腫瘤等重要作用[3]。本文采用孔徑、極性等有顯著性差異，廣泛應(yīng)用于中草藥化學(xué)成分分離與富集[4]，選擇吸附性較好的大孔吸附樹脂對(duì)黃連小檗堿進(jìn)行分離純化研究。

1 儀器與試藥

黃連，購(gòu)于貴陽(yáng)市花溪區(qū)中西藥結(jié)合第四藥店，經(jīng)鑒定為毛茛科植物黃連；鹽酸小檗堿標(biāo)準(zhǔn)品，中國(guó)藥品生物制品檢定所；大孔吸附樹脂，天津南開大學(xué)化工廠；FA1004電子天平，青島揚(yáng)中儀器有限公司；UNICO UV-2000型紫外-可見分光光度計(jì)，上?？蠌?qiáng)儀器有限公司；RE-200型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上?？婆d儀器有限公司；KS康氏振蕩器，上海圣科儀器設(shè)備有限公司；LGJ-10冷凍干燥機(jī)，河南兄弟儀器設(shè)備有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 方法

2.1.1 黃連的前處理

將黃連放入50℃烘箱中烘烤變脆，粉碎，放入冰箱保存。

2.1.2 黃連小檗堿浸出液的制備

稱取適量處理好的黃連，用9倍體積60%乙醇（W/V），60℃回流提取2次，每次提取1 h，合并提取液，50℃減壓濃縮，備用。

2.1.3 大孔吸附樹脂柱層析

2.1.3.1 樹脂的預(yù)處理 樹脂先用蒸餾水浸泡24 h，充分溶脹，濾去浮在表面的樹脂顆粒，然后用4 mol/L的NaOH浸泡12 h，用蒸餾水洗至中性；再用4 mol/L的HCl浸泡12 h，用蒸餾水洗至中性；最后用乙醇浸泡6 h，再用水洗至無醇味，備用。

2.1.3.2 層析分離純化 將浸出液用60%乙醇配制成濃度約為3.5 mg/ml的黃連小檗堿提取液，過濾，上樣，洗脫，收集洗脫液，濃縮，冷凍干燥得產(chǎn)品。

2.1.4 黃連小檗堿測(cè)定方法

采用分光光度法，以鹽酸小檗堿為標(biāo)準(zhǔn)品，準(zhǔn)確配制3、6、9、12、15、18 μg/ml標(biāo)準(zhǔn)溶液，于345 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，由最小二乘法得濃度與吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，并根據(jù)此方程計(jì)算黃連小檗堿含量[5-6]。

2.2 結(jié)果

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線方程

根據(jù)“2.1.2”結(jié)果，用最小二乘法作線性回歸，得鹽酸小檗堿濃度C（μg/ml）與吸光度A的關(guān)系：A=0.05 491C-0.031 42（r=0.999 9）。

2.2.2 樹脂吸附量的測(cè)定

稱取不同型號(hào)樹脂10份（已處理），每份5 g，置于具塞三角瓶中，各加入30 ml濃度為3.44 mg/ml的黃連小檗堿提取液，振蕩20 h，振蕩頻率為240次/min。振蕩后，濾過，測(cè)定濾液中黃連小檗堿濃度，計(jì)算各樹脂吸附量（mg/g），結(jié)果見表1。

式中Q為吸附量，C0為起始濃度，CR為剩余濃度，V為溶液體積，W為樹脂重量。

表1 不同樹脂對(duì)黃連小檗堿的吸附量Tab.1 Berberine absorption performance of different resins

從表1可見，在設(shè)定實(shí)驗(yàn)條件下，D101、X-5、NKA-2、H103大孔吸附樹脂對(duì)黃連小檗堿的吸附量較高。

2.2.3 解吸率的測(cè)定

選擇“2.2.2”篩選出的4種樹脂，每種樹脂稱取4份，每份5 g，按照“2.2.2”方法吸附，濾過，風(fēng)干，在濾出樹脂中分別加入30 ml濃度為30%、50%、70%、90%的乙醇，按“2.2.2”振蕩條件，振蕩10 h，過濾，測(cè)定濾液中黃連小檗堿濃度，計(jì)算解吸率（%）。結(jié)果見圖1。

結(jié)果表明，D101大孔吸附樹脂的解吸率最高，70%乙醇在所考察溶劑中對(duì)黃連小檗堿解吸能力最強(qiáng)。

2.2.4 不同洗脫劑的洗脫結(jié)果

稱取D101大孔吸附樹脂9份（已處理），每份30 g，分別裝柱，量取30 ml濃度為3.52 mg/ml的黃連小檗堿提取液，上樣，分別用濃度為10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%的乙醇洗脫，流速為2 ml/min，至流出液無色，收集洗脫液，濃縮，60%乙醇定容至50 ml，測(cè)定黃連小檗堿含量。見圖2。

結(jié)果表明，60%乙醇對(duì)黃連小檗堿洗脫率最高。

綜合“2.2.3”和“2.2.4”實(shí)驗(yàn)結(jié)果：D101大孔吸附樹脂靜態(tài)吸附量為18.08 mg/g，靜態(tài)及動(dòng)態(tài)解吸率均為95%以上，為所考察樹脂中最好的。

2.2.5 樹脂吸附-解吸影響因素

2.2.5.1 pH的影響 稱取D101大孔吸附樹脂5份（已處理），每份5 g，于具塞三角瓶中，各加入30 ml濃度為3.42 mg/ml的黃連小檗堿提取液，用1 mol/L的NaOH和1 mol/L的HCl溶液將各提取液分別調(diào)至設(shè)定的pH值，按“2.2.2”振蕩條件，振蕩20 h，濾過，測(cè)定濾液中黃連小檗堿濃度，計(jì)算吸附量（mg/g）。見圖3。

結(jié)果表明，D101大孔吸附樹脂在酸性環(huán)境下對(duì)黃連小檗堿的吸附量?jī)?yōu)于堿性環(huán)境。

2.2.5.2 溫度對(duì)吸附的影響 稱取D101大孔吸附樹脂5份（已處理），每份5 g，于具塞三角瓶中，各加入30 ml濃度為3.46 mg/ml的黃連小檗堿提取液，分別在設(shè)定溫度下水浴加熱，按“2.2.2”振蕩條件，每隔10 min振蕩30 s，加熱時(shí)間為2 h。加熱后，過濾，60%乙醇定容至50 ml，測(cè)定黃連小檗堿濃度。見圖4。結(jié)果表明，在室溫下，樹脂的吸附量最高。

2.2.5.3 洗脫劑用量的影響 稱取D101大孔吸附樹脂 （已處理）30 g，裝柱，量取30 ml濃度為3.55 mg/ml的黃連小檗堿提取液，上樣，60%乙醇洗脫，流速為2 ml/min，收集洗脫液，濃縮，測(cè)定黃連小檗堿含量。見圖5。

結(jié)果表明，4倍樹脂體積洗脫劑用量時(shí)，解吸率已達(dá)到95.25%，繼續(xù)增加洗脫劑用量，洗脫率沒有顯著增加。

2.2.5.4 洗脫速度的影響 稱取D101大孔吸附樹脂5份（已處理），每份30 g，分別裝柱，量取30 ml濃度為3.57 mg/ml的黃連小檗堿提取液，上樣，60%乙醇分別以設(shè)定流速洗脫，至流出液無色，收集洗脫液，濃縮，測(cè)定黃連小檗堿的含量。見圖6。結(jié)果表明，洗脫率最高時(shí)，洗脫速度為2 ml/min。

2.2.5.5 分離純化后的產(chǎn)品 量取100 ml濃度為3.43 mg/ml的黃連小檗堿提取液，上D101大孔吸附樹脂柱，依次用水、60%乙醇洗脫，后者用量為4～5倍樹脂體積，濃縮洗脫液至干，冷凍干燥后，得產(chǎn)品，結(jié)果見表2。

表2 分離純化后的產(chǎn)品數(shù)據(jù)Tab.2 Data of purified product

3 結(jié)論

本文從樹脂選用、影響樹脂分離純化的因素出發(fā)，對(duì)大孔吸附樹脂分離純化黃連小檗堿進(jìn)行了探討。實(shí)驗(yàn)表明，D101大孔吸附樹脂作為分離純化樹脂，先水洗除雜，再用4～5倍樹脂體積的60%乙醇洗脫，濃縮洗脫液，冷凍干燥后的產(chǎn)品中黃連小檗堿的含量為30.02%，收率為9.12%。

[1]毛堂峰,顏謙,方周伯,等.黃連細(xì)胞培養(yǎng)物中小檗堿的分離與鑒定[J].生物工程學(xué)報(bào),1997,13(3):284-288.

[2]王秀杰.黃連的藥理研究及現(xiàn)代應(yīng)用[J].中國(guó)藥師,2003,6(6):370.

[3]田智勇,李振國(guó).黃連的研究新進(jìn)展[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥,2004,15(10):704-706.

[4]李月,陳瑩.大孔吸附樹脂分離純化銀杏葉總黃酮的研究[J].化學(xué)與生物工程,2009,26(7):55-57.

[5]孫波,張永光.正交法優(yōu)選黃連中鹽酸小檗堿的提取工藝[J].海峽藥學(xué), 1999,11(2):100-101.

[6]魏英勤,房海燕,袁久榮.影響大孔樹脂吸附黃連提取液的因素[J].中國(guó)藥業(yè),2003,(2):44.

Study on separation and purification of berberine in Coptis chinensis by macroporous adsorption resin

XI Guoping,SONG Guobin
(The Medical College of Datong University,Shanxi Province,Datong 037009,China)

Objective:To study on separation and purification of berberine in Coptis chinensis by macroporous adsorption resin.Methods:From the 10 kinds of different macroporous adsorption resins,the D101 resin which the adsorption performance was 18.08 mg/g and the desorption ratio was over 95%was selected to separate the berberine in Coptis chinensis.Results:The desorption ratio of over 95%could be gotten by using 60%ethanol as eluting solvent and 4-5 BV.Under these experiment conditions,the content of berberine in products was 30.02%and the yield was 9.12%.Conclusion:The method is easy,possessed of popularization and application value.It can be used for separation berberine from Coptis chinensis.

Coptis chinensis;Berberine;Separation;Purification

R284.2

A

1673-7210（2011）02（b）-044-03

席國(guó)萍（1979-），女，山西隰縣人，講師，碩士學(xué)歷；研究方向：植物有效成分提取、分離、檢測(cè)。

2010-09-20）