蔡興東，楊建平，黃 春，沈 力，李潤琴，劉 丹，張樂星

(重慶三峽醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，重慶萬州 404020)

高效液相色譜法測定川東獐牙菜中獐牙菜苦苷的含量

蔡興東，楊建平，黃 春，沈 力，李潤琴，劉 丹，張樂星

(重慶三峽醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，重慶萬州 404020)

目的：建立川東獐牙菜中獐牙菜苦苷的含量測定方法。方法：采用高效液相色譜法，Crest C18（4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱，流動相：甲醇-水（25∶75），流速：1 ml/min，檢測波長：254 nm，柱溫：25℃。結(jié)果：獐牙菜苦苷在0.4～2.0 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r=0.999 9），平均回收率為99.78%，RSD=1.86%（n=6）。結(jié)論：該方法簡便、準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好,可作為川東獐牙菜中獐牙菜苦苷的含量測定方法。

川東獐牙菜；獐牙菜苦苷；含量測定

川東獐牙菜（Swertia davidi Franch.）又名水靈芝、魚膽草、青魚膽草、水黃連，為龍膽科獐芽菜屬植物川東獐牙菜的干燥全草。《四川省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》1987年版以魚膽草名收載，具有清熱解毒、利膽健胃等功效，民間常用于各種類型肝炎及膽囊炎等的治療。有研究表明，川東獐牙菜的苦苷類成分有明顯的抗腫瘤作用[1]，其提取物制成的注射劑對革蘭陽性菌具有較強(qiáng)的抑制作用[2]。川東獐牙菜僅在長江上游及其烏江支流一帶海拔130～170 m的河谷地帶生長，三峽庫區(qū)蓄水175 m后，失去自然生長條件成為瀕危藥用植物，有學(xué)者對其進(jìn)行了生藥學(xué)和引種栽培研究，現(xiàn)已實現(xiàn)人工種植[3-6]。川東獐牙菜具有廣闊的開發(fā)利用前景，而其相關(guān)研究報道卻不多，為進(jìn)一步深入研究、開發(fā)利用川東獐牙菜，本實驗采用高效液相色譜法對川東獐牙菜中的有效成分之一獐牙菜苦苷含量進(jìn)行了測定，為川東獐牙菜的質(zhì)量控制提供了參考。現(xiàn)將實驗內(nèi)容介紹如下：

1 儀器與試藥

1.1 儀器

島津 LC-2010A高效液相色譜儀，紫外檢測器，BSA124S-CW型萬分之一電子天平（德國賽多利斯）；MILLIQ BIOCEL超純水機(jī) （法國密理博公司）；KQ-250DA型數(shù)控超聲清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

獐牙菜苦苷對照品（批號：09110401），購于成都普思生物科技有限公司（純度＞98%）；川東獐牙菜藥材，購于萬州，經(jīng)重慶三峽中藥研究所沈力教授鑒定為龍膽科（Gentianaceae）獐牙菜屬植物川東獐牙菜（Swertia davidi Franch.）；甲醇為色譜純；水為超純水，其他試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Crest C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱；甲醇-水（25∶75）為流動相，流速為1 ml/min，檢測波長為254 nm，柱溫為25℃。

2.2 對照品溶液制備

取獐牙菜苦苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每毫升含0.1 mg的溶液，經(jīng)0.45 μm的濾膜過濾，即得。

2.3 供試品溶液制備

稱取經(jīng)干燥粉碎的川東獐牙菜樣品約1.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 ml，精密稱定重量，超聲處理50 min，放冷，補(bǔ)足甲醇量，0.45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液1 ml，甲醇稀釋至10 ml，即得。

2.4 系統(tǒng)適用性試驗

分別取對照品溶液和供試品溶液以，按上述色譜條件進(jìn)行試驗，考察系統(tǒng)適用性。HPLC色譜圖見圖1。

2.5 線性關(guān)系考察

精密吸取獐牙菜苦苷對照品溶液4、8、12、20 μl，注入色譜儀，測定峰面積積分值。以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積積分值為縱坐標(biāo)，計算得回歸方程：Y=6 355.8X-1 689.8（r=0.999 9），獐牙菜苦苷的線性范圍為0.4～2.0 μg。

2.6 穩(wěn)定性試驗

取對照品溶液在0、2、4、8、12、24、48 h分別進(jìn)樣測定，結(jié)果基本一致，RSD=1.08%，表明溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 精密度試驗

按上述色譜條件取獐牙菜苦苷對照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，測定峰面積積分值，RSD=0.4%，表明精密度良好。

2.8 重現(xiàn)性試驗

取同一批川東獐牙菜藥材樣品5份，精密稱定，依法測定含量，RSD=1.63%（n=5）。表明重現(xiàn)性良好。

2.9 回收率試驗

采用加樣法，取同一供試品6份，精密加入獐牙菜苦苷對照品溶液，分別依法測定獐牙菜苦苷含量，計算回收率，結(jié)果見表1。

2.10 樣品含量測定

參照供試品溶液制備項下要求，制備樣品溶液，精密吸取對照品溶液和樣品溶液各10 μl，分別注入液相色譜儀中，依法測定，按外標(biāo)法計算獐牙菜苦苷含量。3批樣品中獐牙菜苦苷含量的測定結(jié)果見表2。

表1 獐牙菜苦苷回收率試驗（n=6）Tab.1 Recovery test of Swertiamarin（n=6）

表2 樣品含量測定結(jié)果（n=3）Tab.2 Content determination results of samples（n=3）

3 討論

3.1 流動相選擇

實驗中曾參照文獻(xiàn)[7]采用甲醇-水（20∶80）為流動相，獐牙菜苦苷保留時間較長，約26 min，調(diào)整流動相比例至甲醇-水為25∶75，獐牙菜苦苷于14.5 min左右出峰，與其他成分達(dá)基線分離，分離度大于1.5，且峰形對稱尖銳。

3.2 提取條件的選擇

獐牙菜苦苷易溶于甲醇，因此采用甲醇作提取溶劑。實驗中參照文獻(xiàn)[7-8]選取了超聲提取法對川東獐牙菜藥材樣品中的獐牙菜苦苷進(jìn)行提取，實驗中分別在30、40、50、60 min考察了超聲提取時間對獐牙菜苦苷含量的影響，結(jié)果表明超聲處理50 min后提取液中獐牙菜苦苷含量不再增加，表明50 min已提取完全。

本實驗采用高效液相色譜法，對川東獐牙菜中獐牙菜苦苷進(jìn)行含量測定，從實驗結(jié)果可以看出，供試品中獐牙菜苦苷得到了較好的分離，且無干擾；并經(jīng)方法學(xué)考察，本法簡便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可以為川東獐牙菜的質(zhì)量控制提供參考，為進(jìn)一步開發(fā)利用川東獐牙菜打下基礎(chǔ)。

[1]趙李劍,左澤乘,鄒洪波,等.川東獐牙菜苦苷類成分的提取及體外抗腫瘤作用研究[J].中醫(yī)藥導(dǎo)報,2006,12(5):62-64.

[2]劉士尋.川東獐牙菜對幾種菌株的抑制試驗[J].甘肅畜牧獸醫(yī),2003,33 (3):18-19.

[3]付紹智,余甘霖,沈力.川東獐牙菜繁殖方法比較[J].中藥材,2002,25(9): 622-623.

[4]涂建雄.川東獐牙菜的生藥學(xué)研究[J].湖南中醫(yī)藥導(dǎo)報,1999,5(12):12.

[5]黃衡宇,李鸝,陳義光.川東獐牙菜的引種栽培研究[J].武漢植物學(xué)研究,2002,20(2):145-149.

[6]李濤,曹玉娟,趙敏慧.川東獐牙菜引種栽培研究[J].玉溪師范學(xué)院學(xué)報,2006,22(9):94-98.

[7]胥秀英,唐春紅,鄭一敏,等.高效液相色譜法測定川東獐牙菜中獐牙菜苦苷的含量[J].中國藥科大學(xué)學(xué)報,2003,34(5):475-476.

[8]夏從龍,劉光明,王胤.高效液相色譜法測定麗江獐牙菜中4種有效成分的含量[J].中國醫(yī)院藥學(xué)雜志,2007,27(5):598-601.

Determination of Swertiamarin in Swertia davidi Franch.by HPLC

CAI Xingdong,YANG Jianping,HUANG Chun,SHEN Li,LI Runqin,LIU Dan,ZHANG Lexing
(Chongqing Three Gorges Medicine School,Wanzhou 404020，China)

Objective:To establish a method for the determination of Swer-tiamarin in Swertia davidi Franch.by HPLC.Methods:High performance liquid chromatography was performed on C18column.The chromatographic conditions were as follows:methyl alcohol-water(25∶75)as mobile phase，flow rate being 1.0 ml/min,the detecting wavelength at 254 nm and column temperature being 25℃.Results:Swertiamarin had good linear relation within the range from 0.4 to 2.0 μg (r= 0.999 9).The average recovery was 99.78%with a RSD of 1.86%(n=6).Conclusion:This method is convenient,accurate, reproducible,and can be used for content determinaton of Swertiamarin in Swertia davidi Franch..

Swertia davidi Franch.;Swertiamarin;Content determination

R284.1

A

1673-7210（2011）02（b）-042-02

重慶市教育委員會科學(xué)技術(shù)研究項目資助（No：KJ082102）。

蔡興東（1977.9-），四川資中人，碩士學(xué)歷，講師，研究方向為天然藥物研究。

楊建平（1955.10-），重慶忠縣人，病理學(xué)教授。

2010-12-14）