張秀秀,魏學智,張 強,徐建國,邰源臨

(1.山西師范大學生命科學學院,山西臨汾 041000;2.山西師范大學工程學院,山西臨汾 041000;3.水利部水土保持植物開發(fā)管理中心,北京 100083)

蕤核 (Prinsepia unifloraBatal.)是薔薇科扁核木屬 (Prinsepia Royle)植物,生長于 800～1 000 m的向陽山坡,分布于山西,陜西,內(nèi)蒙古,甘肅等地[1],是黃土高原地區(qū)的鄉(xiāng)土植物。蕤核具有耐旱、耐寒、耐貧瘠和保持水土的作用,是我國水土保護造林的良好樹種。另外,蕤仁還具有疏風散熱、養(yǎng)肝明目的藥用價值[2]。長期以來,對扁核木屬的研究主要集中于引種栽培[3-5]、光合特性[6]和蕤仁的藥用研究等方面。近期研究發(fā)現(xiàn),薔薇科扁核木屬植物葉片中含有含有熊果酸、齊墩果酸等生物活性物質(zhì),這些化合物對淋巴細胞變異有顯著的抑制作用[7-8]。黃酮類物質(zhì)作為一種生物活性物質(zhì),對人類的腫瘤、衰老、心血管等疾病的預防和治療具有重要意義[9-11],因此對蕤核葉片中黃酮類物質(zhì)提取工藝的研究具有重要價值。

本實驗首次對蕤核葉片中的黃酮類物質(zhì)進行提取,就影響蕤核葉片總黃酮提取率的幾個重要因素作了系統(tǒng)研究。選取超聲提取時間、乙醇濃度,液固比和提取溫度做為影響因素,以總黃酮得率為響應值,根據(jù) Box-Benhnken中心組合設計實驗[12]。運用響應面法對提取工藝進行了優(yōu)化,建立了超聲波輔助提取工藝的優(yōu)化數(shù)學模型,并對該優(yōu)化模型的擬合效果進行了檢驗和驗證,確定了蕤核葉片總黃酮提取的最佳條件。

1 材料與方法

1.1 實驗材料和儀器

蕤核葉片采自山西省臨汾市龍祠村。烘干,粉碎過 60目篩后備用。蘆丁標準品 (國藥集團化學試劑有限公司),其余所用試劑均為分析純。

RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,上海青浦滬西儀器廠;SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵,鄭州長城科工貿(mào)有限公司;721型可見分光光度計,上海天普分析儀器有限公司;101-3BS型電熱鼓風干燥箱,金壇市榮華儀器有限公司;KQ-500E超聲波清洗器,昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 總黃酮含量的測定

參照總黃酮[13]的測定方法。以吸光度值 A為縱坐標,濃度 C(mg·L-1)為橫坐標繪制標準曲線,進行線性回歸,求得其回歸方程為:A=0.0113C+0.0005(R2=0.9998)。

1.2.2 實驗設計

(1)單因素實驗

準確稱取 1.0 g蕤核葉片粉末,放入 150 mL錐形瓶中,在其他條件相同的情況下,采用不同超聲提取時間、乙醇濃度、液固比、提取溫度進行提取、過濾、定容,計算總黃酮得率,逐個考察各提取條件對提取效果的影響。

(2)Box-Benhnken中心組合設計實驗

根據(jù)單因素實驗結(jié)果,以影響蕤核葉片總黃酮得率的主要因素為輸入變量,以總黃酮得率為指標,進行 Box-Benhnken中心組合設計實驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 蕤核葉片總黃酮超聲波提取單因素實驗

2.1.1 超聲時間對蕤核葉片總黃酮得率的影響

在乙醇濃度 60%、液料比為 20∶1、提取溫度為70℃的條件下,不同超聲時間對蕤核葉片總黃酮得率的影響結(jié)果見圖1。

圖1 超聲時間對總黃酮得率的影響

由圖1可知,超聲 20～40 min內(nèi)總黃酮得率隨著時間的增加呈上升趨勢,這是因為隨著時間的延長,反應進行的比較完全,蕤核葉片中的黃酮成分不斷地溶出,使得得率上升。但繼續(xù)延長提取時間,黃酮成分已基本溶出,使得總黃酮得率不升反降,表明過長時間的提取無法增加總黃酮的得率,并且延長提取時間還會增加能耗。

2.1.2 乙醇濃度對蕤核葉片總黃酮得率的影響

圖2 不同乙醇濃度對總黃酮得率的影響

在液料比為 20∶1、超聲時間 40 min、提取溫度為 70℃的條件下,不同乙醇濃度對蕤核葉片總黃酮得率的影響結(jié)果見圖2。

由圖2可知,隨著乙醇濃度的提高,蕤核葉片總黃酮得率呈上升趨勢,當乙醇濃度達到 60%時總黃酮得率最大,之后隨著濃度的增加,得率反而降低。乙醇濃度過高時,一些醇溶性雜質(zhì)、親脂性強的成分溶出量增加,這些成分與蕤核黃酮競爭乙醇 -水分子結(jié)合,使溶液黏度變大,增大了傳遞過程中溶劑的阻力,減緩了黃酮向主體溶劑的擴散,減少了粉末表面與溶劑之間黃酮的濃度差,從而導致黃酮提取得率的減少。

2.1.3 液料比對蕤核葉片總黃酮得率的影響

在乙醇濃度 60%、超聲時間 40 min、提取溫度為 70℃的條件下,不同液料比對蕤核葉片總黃酮得率的影響結(jié)果見圖3。

圖3 液料比對總黃酮提取率的影響

由圖3可知,當液料比小于 20∶1時,隨著液料比的增加,總黃酮的得率隨之增加,在液料比為 20∶1時達到峰值,這是因為隨著溶劑倍數(shù)的增大,溶劑與蕤核葉片粉末之間的接觸面變大,從而有利于促進蕤核葉片中黃酮成分的溶出,但過高的液料比反而使總黃酮得率降低。

2.1.4 提取溫度對蕤核葉片總黃酮得率的影響

在乙醇濃度 60%、超聲時間 40 min、液料比為20∶1的條件下,不同提取溫度對蕤核葉片總黃酮得率的影響結(jié)果見圖4。

圖4 提取溫度對總黃酮得率的影響

從圖4可以看出,隨著溫度的升高,溶劑的粘度減小,分子運動速度加快,提取液的擴散系數(shù)增加,促使提取速度加快?？傸S酮的提取率隨溫度的升高而增加,當溫度達到 70℃時,溫度再增加,提取率增加較小,考慮到溫度高于乙醇沸點易揮發(fā),因此提取溫度范圍選擇 60℃～80℃之間為宜。

2.2 超聲波輔助提取工藝優(yōu)化模型的建立

表1 實驗因素和水平編碼值

在單因素實驗的基礎上,根據(jù) Box-Behnken中心組合原理設計了 4因素 3水平的響應面法實驗,實驗因素及水平編碼見表1。

由Design Expert 7.1.6的試驗設計功能可知,Box-Behnken中心組合實驗包括 29個試驗點,分為兩類:其一是因析點,自變量取值在 A、B、C、D、所構(gòu)成的三維定點,共有 24個因析點;其二是零點,為區(qū)域中心點,零點試驗重復 5次用來估計實驗誤差。

由方差分析可知:回歸的失擬性檢驗 P>0.05,差異不顯著,可以認為所選用的二次回歸模型是適當?shù)?回歸方程的顯著性檢驗 P<0.001,極顯著,說明模型的預測值與實際值非常吻合,模型成立。對回歸系數(shù)顯著性檢驗,在α=0.05顯著水平剔除不顯著項,得到的優(yōu)化后的方程為:Y=0.130+0.051A+0.027B+0.030C-0.033AB+0.033AC+0.034AD-0.078BD-0.078A2-0.106B2-0.048C2-0.038D2。

各因素的 F值可以反映出各個因素對實驗指標的重要性,F值越大,表明對實驗指標的影響越大,即重要性越大。實驗可得,影響蕤核葉片總黃酮得率順序為:A(超聲波提取時間)>C(液料比)>B(乙醇濃度)>D(提取溫度)。

由方差分析可知,AB,AC,AD和 BD之間存在交互作用,因此剔除不顯著項后的回歸方程中,固定兩個因素在零水平上,研究另兩個因素間的交互作用。分析結(jié)果見圖5～7。

由圖5～7可知,隨著超聲時間 A和乙醇濃度B的增加,蕤核葉片中總黃酮的提取率呈上升趨勢,達到一定程度時,總黃酮的提取率最大;但當超聲時間和乙醇濃度繼續(xù)增加時,提取率開始下降。因此只有它們?nèi)≈颠m中時,才能獲得最高的總黃酮提取率。超聲時間 A與液料比 C具有正相關的協(xié)同作用,交互作用可以獲得更高的總黃酮提取率,但二者增大到一定值時,提取率增加的不明顯。超聲時間 A與提取溫度 D的交互作用表明,提取溫度和提取時間在零水平以下時,提取率隨著水平的增加而明顯增加;當二者在零水平以上時,提取率隨水平的增加而下降,原因是高溫長時間對提取率并沒有太大的促進,反而會影響提取效果。因此,只有當提取時間、乙醇濃度、料液比、提取溫度合理搭配時才能獲得更好的提取效果。

圖5 超聲時間和乙醇濃度對總黃酮提取率的交互作用分析

圖6 超聲時間和液料比對總黃酮提取率的交互作用分析

圖7 超聲時間和提取溫度對總黃酮提取率的交互作用分析

通過回歸模型預測,可以得到蕤核葉片總黃酮提取的最佳工藝條件為,超聲時間 50.1 min,乙醇濃度59.5%,液料比 24.9∶1和提取溫度 72.8℃。在此條件下,模型預測總黃酮得率可以達到 1.149 mg·g-1。

取 2.000 g蕤核葉片樣品,在以上最佳條件下提取,重復 3次取平均值,測得蕤核葉片總黃酮得率為 Y=0.151 mg·g-1,與理論值 (1.149 mg·g-1)非常接近,其相對誤差為 0.17%,進一步驗證了數(shù)學回歸模型的適合性 (表2)。

表2 最佳工藝條件驗證結(jié)果

3 結(jié) 論

本文在單因素實驗的基礎上,將響應面法應用于優(yōu)化超聲波提取蕤核葉片中的總黃酮。建立的蕤核葉片總黃酮提取條件優(yōu)化模型為:Y=0.130+0.051A+0.027B+0.030C-0.033AB+0.033AC+0.034AD-0.078BD-0.078A2-0.106B2-0.048C2-0.038D2。采用此模型在本實驗范圍內(nèi)能較準確地預測蕤核葉片中總黃酮得率。

通過實驗結(jié)果的方差分析可知,在本實驗范圍內(nèi),各因素對蕤核葉片中的總黃酮得率的影響作用大小順序為超聲時間 >液料比 >乙醇濃度 >提取溫度。

超聲波提取蕤核葉片中總黃酮的最優(yōu)工藝條件為:超聲時間 50.1 min,乙醇濃度 59.5%,液料比24.9∶1和提取溫度 72.8℃。在此條件下,總黃酮得率可以達到 1.151 mg·g-1,其總黃酮含量僅次于香椿:1.725 mg·g-1,而比菠菜 (0.102 mg·g-1)、韭菜 (0.062 mg·g-1)和黃花菜 (0.527 mg·g-1)含量都高。實驗結(jié)果與理論得率極為接近,本實驗建立的優(yōu)化模型對蕤核葉片總黃酮的開發(fā)利用具有指導意義。

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