陶永清，劉崇基，李健嬌，徐新，王津晗，韓娜，張磊，趙輝，阮海華，王昌祿

沙門菌是嚴重威脅人類健康的主要食源性致病菌之一。據(jù)統(tǒng)計，在世界各國的細菌性食物中毒中，沙門菌引起的食物中毒常列榜首[1]，我國內(nèi)陸地區(qū)也以沙門菌導致的食物中毒為首位[2]。

SopB 是沙門菌主要致病性蛋白成分，是由沙門菌 SPI-1 III 型分泌系統(tǒng)分泌的一種由 561 個氨基酸構(gòu)成的蛋白質(zhì)分子，具有肌醇磷脂酶（phosphoinositide phosphatase）活性[3]。SopB 在沙門菌感染過程中發(fā)揮著不同的重要功能[4-8]。細胞蛋白激酶 MAPK，包括 Erk1/2（extracellular signalregulated kinases 1 and 2）、p38（P38 mitogenactivated protein kinases）和 JNK（c-Jun N-terminal kinases），其對沙門菌感染均具有重要的調(diào)節(jié)作用，因此，研究 SopB 對細胞蛋白激酶 MAPK 信號的影響非常必要。本文采用基因克隆的方法將沙門菌SopB 基因克隆至質(zhì)粒載體上，檢測 SopB 在細胞中的過量表達對細胞蛋白激酶 MAPK 磷酸化水平的調(diào)節(jié)作用，為 SopB 的功能研究提供更多的信息。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株、宿主菌和質(zhì)粒載體 鼠傷寒沙門菌 Salmonella Typhimurium LT2、大腸桿菌E. coli Trans 10 宿主菌由本實驗室保存；表達用質(zhì)粒 pCS2-EGFP 由本實驗改造，該質(zhì)粒由 pCS2 改造而來，將綠色熒光蛋白（GFP）的基因克隆至質(zhì)粒表達框的 N 端，并在 pCS2 質(zhì)粒的多克隆位點（MCS）上加入 FseI 和 AscI 兩個酶切位點。

1.1.2 酶和試劑 質(zhì)粒 DNA 提取試劑盒和膠回收試劑盒為英國 Omega 公司產(chǎn)品；Vent DNA polymeras 和限制性內(nèi)切酶 FseI 和 AscI 購自美國 NEB 公司；細菌基因組提取試劑盒購自北京天根公司；T4 DNA 連接酶購自美國 Promega 公司；PVDF 膜購自德國 Milipore 公司；兔抗、Tubulin單抗購自美國 Cell Signaling 公司；其他試劑為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計與合成 根據(jù) GenBank 上已登錄的鼠傷寒沙門菌 Salmonella Typhimurium LT2基因組的全序列（NC_003197）查找到 SopB 基因序列（NP_460064.1）。利用 Primer 5.0 軟件設(shè)計引物，以擴增 SopB 基因的全序列。根據(jù) SopB 基因全序列設(shè)計相應的引物，以擴增 SopB 基因的Δ29、Δ46 以及 Δ112 的各種基因片段。引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成，引物序列見表 1。1.2.2 重組質(zhì)粒 pCS2-EGFP-SopB 以及各種truncation 的構(gòu)建 將沙門菌 LT2 接種于普通LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃ 培養(yǎng) 18 h。取 1 ml 菌液提取基因組 DNA，具體操作參照試劑盒推薦的方法，提取的基因組 DNA 經(jīng) 0.8% 瓊脂糖凝膠電泳檢測，–20 ℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

表 1 SopB 以及各種 SopB 基因片段的擴增與載體構(gòu)建所用的引物Table 1 Primers for cloning of SopB and its several derives of truncations

以該基因組 DNA 作為模板，利用 P1-FseI 和P2-AscI 引物進行 PCR 擴增。反應條件為：94 ℃6 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，30 個循環(huán)；72 ℃ 10 min。瓊脂糖凝膠電泳檢測 PCR 產(chǎn)物?；厥占兓?PCR 產(chǎn)物，用限制性內(nèi)切酶 FseI 和AscI 進行雙酶切并純化。同時將質(zhì)粒 pCS2-EGFP也經(jīng)同樣雙酶切和純化。其中，pCS2-EGFP 是本實驗室改造的載體，該載體能夠在細胞中高效表達N 端帶有綠色熒光蛋白（GFP）的融合蛋白。把pCS2-EGFP 與目的片段的酶切純化產(chǎn)物用 T4 連接酶體系連接，轉(zhuǎn)化 Trans 10 大腸桿菌感受態(tài)細胞，涂布于含 Ampr的 LB 平板上，37 ℃ 培養(yǎng)12 ～ 16 h。挑取單個菌落接種于含 Ampr的 LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min 振蕩過夜，酶切鑒定，測序確認插入正確。

對 SopB 各種 truncation 的構(gòu)建分別采用 P3與 P2、P4 與 P2、P5 與 P2 引物對進行 PCR 擴增并將其 PCR 產(chǎn)物酶切，連接至 pCS2-EGFP 質(zhì)粒上構(gòu)建重組質(zhì)粒，測序確認插入正確。

1.2.3 定點突變體的構(gòu)建 SopB C460S 突變體的構(gòu)建采用的是 Site-directed Mutagenesis Kit 的方法，如表 1 所示，設(shè)計一對互補的引物 P460F和 P460R，其中的 SopB 第 460 位 Cys 被突變?yōu)?Ser。PCR 反應條件為 94 ℃ 6 min；94 ℃ 30 s，62 ℃ 30 s，72 ℃ 10 min，16 個循環(huán)；72 ℃ 15 min。取 20 μl PCR 產(chǎn)物利用 DpnI 酶切 1 h，將酶切后產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌 Trans 10 感受態(tài)細胞，37 ℃培養(yǎng) 12 ～ 16 h。挑取單個菌落接種于含 Ampr的LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min 振蕩過夜，測序確認基因突變。

1.2.4 利用磷酸鈣法將重組質(zhì)粒 pCS2-EGFPSopB 轉(zhuǎn)染 HeLa 細胞 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 HeLa 細胞采用的是 VigoFect（威格拉斯）試劑，取 5 μg DNA，加入稀釋液中至總體積為 100 μl，輕輕混勻，室溫放置。取 VigoFect 2 μl 加入稀釋液中至總體積為 100 μl，輕輕混勻，室溫放置 5 min。將稀釋的 VigoFect 逐滴加入稀釋的 DNA 溶液中，輕輕混勻，所得的轉(zhuǎn)染工作液在室溫放置 15 min。將轉(zhuǎn)染工作液輕輕混勻，逐滴加入 2 ml 培養(yǎng)液中，輕輕混勻培養(yǎng)液，置 37 ℃，5% CO2培養(yǎng) 24 h 后收集細胞。

1.2.5 Western blot 蛋白表達的檢測采用 western blot 的方法。將收集的細胞進行 SDS-PAGE 電泳，轉(zhuǎn)膜，利用相應的一抗和二抗進行雜交，洗膜，通過辣根過氧化物酶作為底物進行化學發(fā)光，X 光片壓片，洗片。

2 結(jié)果

2.1 SopB 基因表達檢測

圖 1 融合蛋白 GFP-SopB 及其 truncation 在 HeLa 細胞中的表達分析Figure 1 Expression of the recombinant protein GFP-SopB and its truncation derivates in HeLa cells

由于 SopB 的重組質(zhì)粒表達的是 GFP-SopB融合蛋白，因此，首先利用 GFP 蛋白作為標簽檢測了 SopB 及其各種 truncation 在 HeLa 細胞中的表達情況，結(jié)果如圖 1 所示，SopB 全長蛋白及其各種 truncation 均表達，而且其表達量隨著SopB 蛋白的截短而逐漸提高，這可能與 SopB 轉(zhuǎn)染引起的細胞死亡有關(guān)，當 SopB 蛋白的 N 端的112個氨基酸被去掉后，SopB 不再引起細胞死亡，SopB Δ112 的表達量會顯著增加（結(jié)果未列）。2009年，Cell 雜志發(fā)表了SopB蛋白在沙門菌感染宿主細胞的過程中發(fā)生泛素化修飾的結(jié)果，這是 SopB的重要特征[7]。本研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，當 SopB 蛋白在 HeLa 細胞中過量表達時有部分蛋白能夠明顯發(fā)生泛素化修飾，當 SopB 的 N 端 29 以及 46 個氨基酸分別被截取后不影響 SopB的泛素化，當其N 端 112 個氨基酸被截取后，SopB 不再發(fā)生泛素化修飾，這與 Cell 雜志報道結(jié)果相一致，即 SopB發(fā)生泛素化修飾的位點為其 N 端 112 個氨基酸區(qū)域內(nèi)的賴氨酸。與細菌感染實驗不同，將 SopB蛋白在 HeLa 細胞中過量表達僅檢測到 SopB 的單泛素化修飾，而未能檢測到在沙門菌感染實驗中的 SopB 的多泛素化修飾，這可能由于感染過程中有多種因子，包括 LPS、Effector、CpG，DNA 等的參與有關(guān)，所以在沙門菌感染過程中可能存在其他的因素促進 SopB 的多泛素化修飾。

2.2 SopB 的過量表達激活 HeLa 細胞 MAPK 蛋白激酶的磷酸化

由于在沙門菌感染上皮細胞的過程中，LPS、效應分子中的 SopE/SopE2 以及 SpvC 均被發(fā)現(xiàn)對上皮細胞蛋白激酶 MAPK，包括 Erk1/2，p38 和JNK 具有調(diào)節(jié)作用。為研究 SopB 對上皮細胞蛋白激酶 MAPK 的調(diào)節(jié)作用，將 SopB 在細胞中進行表達并檢測細胞蛋白激酶 MAPK 的磷酸化水平。如圖 2 所示，SopB 轉(zhuǎn)染與否對 HeLa 細胞蛋白激酶 Erk1/2、p38 和 JNK 的水平影響不大。但與轉(zhuǎn)染空載體的對照相比，SopB 的表達顯著激活了 pErk1/2、p-p38 以及 pJNK 的磷酸化水平，而當 SopB 肌醇磷脂酶活性關(guān)鍵氨基酸 C460 的突變則不能夠誘導 pErk1/2、p-p38 以及 pJNK 的磷酸化。表明，SopB 對 HeLa 細胞蛋白激酶pErk1/2、p-p38 以及 pJNK 的磷酸化的激活與其肌醇磷脂酶活性直接相關(guān)。

圖 2 SopB 激活 HeLa 細胞 pErk、p-p38 以及 pJNK 的表達Figure 2 SopB activates the level of pErk、p-p38 and pJNK in HeLa cells

2.3 SopB N 端 29 個氨基酸與 HeLa 細胞蛋白激酶 MAPK 的磷酸化激活有關(guān)

為進一步研究 SopB 上與誘導 HeLa 細胞MAPK 蛋白激酶 Erk1/2，p38 和 JNK 激活有關(guān)的結(jié)構(gòu)域，我們通過 PCR 的方法構(gòu)建了 SopB N端分別缺失 29 個、46 個以及 112 個氨基酸的truncation，并將各種 truncation 轉(zhuǎn)染 HeLa 細胞。結(jié)果如圖 3 所示，當 SopB 的 N 端缺失掉 29 個氨基酸后，SopB 不再激活 HeLa 細胞蛋白激酶MAPK 的磷酸化，表明 SopB N 端 29 個氨基酸與 Erk1/2，p38 和 JNK 的磷酸化激活有關(guān)，但是到目前為止，SopB 通過何種機制激活 HeLa 細胞蛋白激酶以及其 N 端 29 個氨基酸在此機制中通過何種方式起作用仍有待于進一步研究。

圖 3 SopB 及其相應 truncation 激活 HeLa 細胞 pErk、p-p38 以及 pJNK 的情況Figure 3 The phosphorylation of pErk、p-p38 and pJNK in HeLa cells induced by SopB and its derivates

3 討論

SopB 是由沙門菌 SPI-1 III 型分泌系統(tǒng)分泌的一種由 561 個氨基酸構(gòu)成的蛋白質(zhì)分子, 是一種肌醇磷脂酶。目前的研究發(fā)現(xiàn)，不同類型的沙門菌基因組間存在不同差異，其致病機制也有差異。但在引起人類疾病的五大類沙門菌中，除鴨沙門菌基因組未測序以外，SopB 廣泛存在于其他幾種能夠?qū)θ祟惔嬖谇秩拘缘牟煌愋偷纳抽T菌中，足見其功能的重要性[6]。

目前已有的研究結(jié)果表明，SopB 的 N 端在SopB 誘導的信號轉(zhuǎn)導途徑中可能發(fā)揮重要的作用，其 N 端是 SopB 發(fā)生泛素化修飾的重要位點，SopB 的泛素化與其在細胞內(nèi)的定位和功能直接相關(guān)[7]。因此，為了進一步研究與 SopB 誘導HeLa 細胞 MAPK 蛋白激酶 Erk1/2，p38 和 JNK激活有關(guān)的結(jié)構(gòu)域，通過 PCR 的方法構(gòu)建了SopB N 端分別缺失 29 個、46 個以及 112 個氨基酸的 truncation，并將各種 truncation 轉(zhuǎn)染 HeLa細胞。結(jié)果如前所示，當 SopB 的 N 端缺失掉 29個氨基酸后，SopB 不再激活 HeLa 細胞蛋白激酶MAPK 的磷酸化，表明 SopB N 端 29 個氨基酸與 Erk1/2，p38 和 JNK 的磷酸化激活有關(guān)，但是到目前為止，SopB 通過何種機制激活 HeLa 細胞蛋白激酶以及其 N 端 29 個氨基酸在此機制中通過何種方式起作用仍不清楚。目前的研究表明，SopE、SopE2 和 SopB 通過不同的機制刺激 Rho-家族 GTP 酶信號，其中 SopE 和 SopE2 是Rac1、Cdc42 和 RhoG 交互作用因子，而 SopB 則是通過其磷脂酰肌醇磷酸酶活性刺激 RhoG 的交互作用蛋白 SGEF 來激活 RhoG[8]，但是目前SopB 通過何種機制激活 Cdc42 尚不清楚。而Cdc42 對于細菌進入細胞雖然可有可無，但是它能夠有效地激活 MAPKs 信號。那么，SopB 激活宿主細胞的 MAPKs 是否與 Cdc42 的激活有關(guān)將是我們今后研究的一個靶點。

[1] Scallan E, Hoekstra RM, Angulo F, et al. Foodborne illness acquired in the United States--major pathogens. Emerg Infect Dis, 2011, 17(1):7-15.

[2] Li TR. The status of chinese food-derived illness and suggestions.Chin J Epidemiol, 2003, 24(8):651-653. (in Chinese)李泰然. 中國食源性疾病現(xiàn)狀及管理建議. 中華流行病學雜志,2003, 24(8):651-653.

[3] Norris FA, Wilson MP, Wallis TS, et al. SopB, a protein required for virulence of Salmonella dublin, is an inositol phosphate phosphatase.Proc Natl Acad Sci U S A, 1998, 95(24):14057-14059.

[4] Knodler LA, Finlay BB, Steele-Mortimer O. The Salmonella effector protein SopB protects epithelial cells from apoptosis by sustained activation of Akt. J Biol Chem, 2005, 280(10):9058-9064.

[5] Drecktrah D, Knodler LA, Galbraith K, et al. The Salmonella SPI1 effector SopB stimulates nitric oxide production long after invasion.Cell Microbiol, 2005, 7(1):105-113.

[6] Mallo GV, Espina M, Smith AC, et al. SopB promotes phosphatidylinositol 3-phosphate formation on Salmonella vacuoles by recruiting Rab5 and Vps34. J Cell Biol, 2008, 182(4):741-752.

[7] Patel JC, Galán JE. Differential activation and function of Rho GTPases during Salmonella-host cell interactions. J Cell Biol, 2006,175(3):453-463.

[8] Bakowski MA, Braun V, Lam GY, et al. The phosphoinositide phosphatase SopB manipulates membrane surface charge and trafficking of the Salmonella-containing vacuole. Cell Host Microbe,2010, 7(6):453-462.