史亞軍，施俊輝，劉劍云，唐梅，黃勤挽，楊明

·論著·

貝加靈噴霧劑對大鼠全腦缺血的保護作用

史亞軍，施俊輝，劉劍云，唐梅，黃勤挽，楊明

目的研究貝加靈噴霧劑對大鼠全腦缺血的保護作用，并初步探討其作用機制。

腦缺血； 自由基清除劑； 腦代謝改善藥；黃苓甙； 動物實驗

www.cmbp.net.cn 中國醫(yī)藥生物技術, 2011, 6(6):450-454

腦缺血損傷指由于腦動脈管腔狹窄或堵塞，局部腦血流量減少或突然中斷，造成該動脈供應區(qū)的腦組織供血、供氧、供能減少，繼而引起繼發(fā)性的血管內(nèi)皮損傷和自主神經(jīng)功能障礙的一種病理狀態(tài)[1]。缺血性腦損傷疾病以其高發(fā)病率、高致殘率和高死亡率而嚴重危害著人們的身心健康。

近年來有學者研究發(fā)現(xiàn)，以黃芩苷為主要成分的黃芩提取物可從抑制興奮性氨基酸毒性作用、抗自由基毒性損傷、干預細胞內(nèi)鈣超載、抑制凋亡調(diào)控基因的激活、抑制炎癥因子的表達，以及保護線粒體功能等方面對中風引起的缺血性腦損傷具有積極的修復治療作用[2]，這無疑對進一步深化對黃芩既往功效的認識，探索利用其新的藥理作用具有積極的意義，同時也對研究開發(fā)治療缺血性腦損傷疾病的藥物給予了積極的推動作用。

貝加靈噴霧劑是以黃芩提取物磷脂復合物為原料制備而成的亞微乳經(jīng)鼻給藥制劑。黃芩提取物因其脂溶性、水溶性差等原因造成體內(nèi)吸收差、生物利用度低，極大影響其藥效的發(fā)揮。根據(jù)前期研究結果[3]，將其制備成磷脂復合物，再制備成亞微乳，提高其溶解度與穩(wěn)定性，增加組織親和力，使其充分發(fā)揮藥效。本實驗通過雙側(cè)頸總動脈結扎復制全腦缺血模型，測定貝加靈噴霧劑對全腦缺血大鼠的腦指數(shù)，觀察腦組織病理形態(tài)學改變，測定大鼠缺血腦組織中超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）和 ATP 酶的含量，研究制劑對全腦缺血模型大鼠腦組織的保護修復作用，并初步探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 健康 SD 大鼠 168 只，體重（250 ± 25）g，雌雄各半，購于成都達碩生物科技有限公司，合格證號：SCXK（川）2010-24，飼養(yǎng)于清潔級動物房。

1.1.2試劑與儀器 貝加靈噴霧劑和空白乳劑為成都中醫(yī)藥大學藥學院中藥藥劑教研室自制；陽性對照品尼莫地平購自山東東方藥業(yè)股份有限公司（批號：1005191）；水合氯醛購自成都市科龍化工試劑廠（批號：20100920）；考馬斯亮藍蛋白測定試劑盒（批號：20101224）、SOD 試劑盒（批號：20101015）、MDA 試劑盒（批號：20101227）、超微量 ATP 酶（總）測試盒（批號：20101119）均購自南京建成生物工程研究所；UV-1700 型紫外可見分光光度計為日本島津公司產(chǎn)品；BS-200s-WEI型電子天平為北京賽多利斯公司產(chǎn)品；FLUKO F6/10-10G 型超細勻漿機為弗魯克（上海）流體機械制造有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1動物分組 大鼠適應飼養(yǎng) 1 周，隨機分為A（手術后給藥 7 d）、B（手術后給藥 15 d）兩大組，每大組再隨機分為 7 小組，即假手術組、模型組（對照組）、貝加靈高劑量組、中劑量組、低劑量組、陽性對照組（尼莫地平組）、空白乳劑組，每組 12 只。

1.2.2給藥方案 A 組在模型制作完成后給藥7 d，B 組在模型完成后給藥 15 d，各組均每日給藥 2 次。給藥劑量：①陽性對照組：尼莫地平以1.00 mg/kg 的劑量注射給藥；②貝加靈高劑量組：以 10.68 mg/kg 的劑量滴鼻給藥；③中劑量組：以 5.32 mg/kg 的劑量滴鼻給藥；④低劑量組：以2.68 mg/kg 的劑量滴鼻給藥；⑤空白乳劑組：按貝加靈中劑量滴鼻給予空白乳劑；⑥假手術組和模型組：通過滴鼻給予中劑量組相同體積的生理鹽水。

1.2.3雙側(cè)頸動脈阻斷法大鼠全腦缺血模型制作 大鼠用 10％ 水合氯醛（35 mg/kg）腹腔注射麻醉。仰臥位固定，碘伏擦拭消毒，腹側(cè)頸正中線切開皮膚，沿胸鎖乳突肌內(nèi)緣分離肌肉和筋膜，分離到氣管前肌后，沿右側(cè)胸鎖乳突肌腱向下分離，見到頸動脈鞘后可上拉鉤，分離雙側(cè)頸總動脈（CCA），用細線分別結扎兩側(cè) CCA，常規(guī)縫合；假手術組只進行麻醉和血管分離術，不結扎血管。手術后 A、B 兩組大鼠分別給藥 7 d 和 15 d。

1.2.4腦指數(shù)的測定 實驗完成后，處死大鼠，稱取全腦重量（g），計算腦指數(shù)，腦指數(shù) = 全腦重量（g）/體重（g）。

1.2.5腦組織切片的制備 大鼠全腦左右半球分開，取右腦放于裝有中性福爾馬林的小瓶內(nèi)作為病理切片用。腦組織以甲醛飽和液和 pH 7.4 的 PBS緩沖液配制的 10％ 中性甲醛固定液（體積比為1∶9）浸泡 8 h，瀝干固定液，依次用 70％、80％、90％、95％ 和無水乙醇浸泡脫水，瀝干，再用二甲苯浸泡 0.5 h，瀝干，浸蠟、包埋，然后切片、攤片、烤片，最后 HE 染色、封片、歸檔。對大鼠腦組織進行病理學損傷評價，根據(jù)形態(tài)學表現(xiàn)按照表 1 評分標準進行評價。

1.2.6大鼠腦組織勻漿液的制備 取左側(cè)腦組織，加 9 倍量生理鹽水于冰浴中用超細勻漿器勻漿 1 min，以 1300 ×g離心 10 min，取上清液，置超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 大鼠病理損傷程度評分標準Table 1 The score standard for the degree of rat brain tissues

1.2.7生化指標的測定 取大鼠腦組織均漿液，參照南京建成生物工程研究所提供的考馬斯亮蘭蛋白濃度、ATP 酶、SOD、MDA 檢測試劑盒的操作說明測定。

1.3 統(tǒng)計學處理

采用 SPSS17.0 統(tǒng)計軟件對每組各指標進行統(tǒng)計學分析。統(tǒng)計采用單因素方差分析和t檢驗，以P＜ 0.05 為統(tǒng)計結果有顯著性差異。

2 結果

2.1 對大鼠腦指數(shù)的影響

手術后給藥 7 d，與假手術組比較，模型組腦指數(shù)顯著增高，表明模型組腦組織水腫明顯；與模型組相比，貝加靈高、中、低劑量組、陽性對照組的腦指數(shù)顯著降低。術后給藥 15 d 的情況與術后給藥 7 d 的類似，但降低腦指數(shù)的效果更明顯。實驗前后，與模型組相比，貝加靈高、中、低劑量組，陽性對照組的體重顯著增加（表 2）。

表2 大鼠腦指數(shù)及體重變化水平（±s，n = 6）Table 2 The level of brain index and weight change of rats (±s, n = 6)

表2 大鼠腦指數(shù)及體重變化水平（±s，n = 6）Table 2 The level of brain index and weight change of rats (±s, n = 6)

注：與模型組相比，aP＜ 0.05，bP＜ 0.01；與治療 7 d 比較，cP＜ 0.05。Notes: Compared with the model group, aP＜ 0.05, bP＜ 0.01; Compared with the 7 d group, cP ＜0.05.

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圖1 大鼠腦組織病理學觀察（A：7 d 模型組；B：7 d 空白乳劑組；C：7 d 陽性對照組；D：7 d 高劑量組；E：7 d 中劑量組；F：7 d 低劑量組；G：15 d 模型組；H：15 d 空白乳劑組；I：15 d 陽性對照組；J：15 d 高劑量組；K：15 d 中劑量組；L：15 d 低劑量組；M：假手術組）Figure 1 Histopathological obserevation of rat brian tissues (A: 7 d model group; B: 7 d blank emulsion group; C: 7 d positive control group; D: 7 d high dose group; E: 7 d middle dose group; F: 7 d low dose group; G: 15 d model group; H: 15 d blank emulsion group; I: 15 d positive control group; J: 15 d high dose group; K: 15 d middle dose group; L: 15 d low dose group; M: Sham operation group)

2.2 對大鼠腦組織病理形態(tài)的影響

大鼠全腦缺血后給藥 7 d 的腦組織病理學切片見圖1A ～ F，可見模型組和空白乳劑組有較多膠質(zhì)細胞增生，水腫較嚴重，而貝加靈高、中、低劑量組和陽性組有輕度水腫；G ～ L 是大鼠全腦缺血后給藥 15 d 的腦組織病理學切片，其情況與術后7 d 類似，但是組織損傷程度評分略有降低，損傷程度評分見表 3。

2.3 大鼠腦組織 SOD 水平

手術后 7 d和 15 d，與假手術組比較，模型組SOD 活力顯著降低；與模型組相比，貝加靈高、中、低劑量組、陽性組的 SOD 含量顯著升高?？瞻兹閯┙M的 SOD 活力高于模型組，但無顯著性差異（P> 0.05）。手術后 7 d SOD 含量與手術后 15 d無顯著性差異（P> 0.05），但是總體有升高趨勢（表 4）。

表3 各組大鼠腦組織病理損傷程度（±s，n = 6）Table 3 The degree of pathological injury of rat brain tissues (±s, n = 6)

表3 各組大鼠腦組織病理損傷程度（±s，n = 6）Table 3 The degree of pathological injury of rat brain tissues (±s, n = 6)

注：與模型組相比，aP＜ 0.05，bP＜ 0.01；與治療 7 d 比較，dP> 0.05。Notes: Compared with the model group,aP＜ 0.05,bP＜ 0.01; Compared with the 7 d group,dP> 0.05.

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2.4 大鼠腦組織 MDA 水平

手術后 7 d和 15 d，與假手術組比較，模型組MDA 含量極顯著升高；與模型組相比，貝加靈高、中、低劑量組和陽性組的 MDA 水平極顯著性降低?？瞻兹閯┙M MDA 含量低于模型組，但是無顯著性差異（P> 0.05），與手術后 7 d 相比，手術后15 d MDA 含量顯著升高（表 5）。

表4 大鼠腦組織 SOD 水平（±s，n = 6）Table 4 The level of SOD of rats (±s, n = 6)

表4 大鼠腦組織 SOD 水平（±s，n = 6）Table 4 The level of SOD of rats (±s, n = 6)

注：與模型組相比，aP＜ 0.05，bP＜ 0.01；與治療 7 d 比較，dP> 0.05。Notes: Compared with the model group,aP＜ 0.05;bP＜ 0.01; Compared with the 7 d group,dP> 0.05.

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表5 大鼠腦組織 MDA 水平（±s，n = 6）Table 5 The MDA level of rat brain tissues (±s, n = 6)

表5 大鼠腦組織 MDA 水平（±s，n = 6）Table 5 The MDA level of rat brain tissues (±s, n = 6)

注：與模型組相比，aP＜ 0.05，bP＜ 0.01；與治療 7 d 比較，cP＜ 0.05。Notes: Compared with the model group,aP＜ 0.05,bP＜ 0.01; Compared with the 7 d group,cP＜ 0.05.

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2.5 大鼠腦組織 ATP 酶水平

手術后 7 d 和 15 d，與假手術組比較，模型組 ATP 酶含量極顯著降低；與模型組相比，貝加靈高、中、低劑量組和陽性組 ATP 酶含量極顯著升高?？瞻兹閯┙M ATP 酶含量低于或高于模型組，但是無顯著性差異（P> 0.05）。與手術后 7 d 相比，手術后 15 d ATP 酶含量顯著降低（表 6）。

表6 大鼠腦組織 ATP 酶水平（±s，n = 6）Table 6 The ATPase level of rat brain tissues (±s, n = 6)

表6 大鼠腦組織 ATP 酶水平（±s，n = 6）Table 6 The ATPase level of rat brain tissues (±s, n = 6)

注：與模型組相比，aP＜ 0.05，bP＜ 0.01；與治療 7 d 比較，cP＜ 0.05。Notes: Compared with the model group,aP＜ 0.05,bP＜ 0.01; Compared with the 7 d group,cP＜ 0.05.

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3 討論

人們對腦缺血的發(fā)病機制認識經(jīng)歷了一個漫長的過程，最初僅停留在腦血流量減少、缺血缺氧、能量代謝障礙的表象認識，隨后逐漸深入到細胞分子方面，其發(fā)病機制涉及腦組織能量代謝緩慢、興奮性氨基酸毒性、自由基損傷、鈣超載、神經(jīng)細胞凋亡等多個環(huán)節(jié)[4]，是一個復雜的病理過程。

氧自由基可以與生物大分子尤其是生物膜上的不飽和脂肪酸反應，形成脂質(zhì)過氧化物（如MDA），破壞膜細胞。由于腦組織中缺乏 SOD、谷胱甘肽過氧化物酶，且富含脂質(zhì)，對氧自由基的損傷尤為敏感，因此自由基在缺血再灌注損傷中起著非常重要的作用。清除自由基、切斷自由基對腦缺血的繼發(fā)性損害是防治急性缺血性腦卒中的重要途徑之一。ATP 酶是存在于組織細胞生物膜上的一種蛋白酶，它在物質(zhì)運送、能量轉(zhuǎn)換及信息傳遞方面具有重要作用，腦缺血缺氧時，ATP 酶活力明顯下降，導致腦細胞代謝異常，細胞膜鈉泵發(fā)生功能障礙，細胞內(nèi)鈉水潴留，從而出現(xiàn)腦細胞水腫，表現(xiàn)為腦指數(shù)和腦含水量增加[5]，同時又可促使腦組織 SOD 活性下降，超氧陰離子大量產(chǎn)生，從而加劇腦細胞損傷[6]。

本實驗結果顯示，貝加靈噴霧劑能明顯對抗大鼠腦缺血導致的腦組織病理損傷，可顯著降低全腦缺血大鼠的腦指數(shù)，明顯改善腦缺血引起的腦神經(jīng)細胞病變，降低缺血性腦組織的含水量；可顯著提高缺血性腦組織中 SOD 活力，抑制 MDA 生成，表明其可通過抗自由基作用對缺血腦細胞起到保護作用；顯著增強缺血性腦組織中 ATP 酶活力，提示其可能通過改善缺血腦細胞能量代謝對受損腦細胞起到修復作用；治療 15 d MDA 與 ATP 酶含量較治療 7 d 都相應地顯著升高與降低，治療15 d SOD 含量較治療 7 d 有升高的趨勢，治療15 d 各組腦指數(shù)顯著低于治療 7 d，說明改善水腫與給藥時間存在一定的時效關系。

從實驗結果可以看出，貝加靈噴霧劑能對抗缺血而導致的大鼠腦組織病理損傷，增強大鼠機體內(nèi)抗自由基能力，改善腦組織能量代謝，對大鼠全腦缺血性腦損傷有一定修復保護作用。這也為貝加靈噴霧劑治療缺血性腦損傷疾病提供一定的實驗依據(jù)，為藥物的進一步研究奠定了基礎。但從實驗結果可以看出，尚無明顯量效關系，可能和鼻腔給藥劑量的準確性有一定關系，后續(xù)將對如何定量準確地給藥作進一步的研究，以期獲得相關數(shù)據(jù)。

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Protective effect of baicalin spray on complete cerebral ischemia in rats

SHI Ya-jun, SHI Jun-hui, LIU Jian-yun, TANG Mei, HUANG Qin-wan, YANG Ming

ObjectiveTo study the protective effect of baicalin spray on complete cerebral ischemia in rats, and to explore its possible therapeutic mechanism.MethodsSD rats were randomly divided into groups A (7 days after operation) and B (15 days after operation). Each group was divided into seven sub-groups that included sham operation group, model group, high dose, middle dose and low dose of baicalin’s spray group, positive control group and blank emulsion group, with 12 rats in each sub-group. Complete cerebral ischemia rat model was established by two artery blocking method, and brain tissue pathomorphology as well as brain index was observed and calculated respectively. Moreover, the content of SOD, MDA and ATPase in brain tissues were measured by spectrophotometric analysis.ResultsBrain indexes of the high, middle and low dose of baicalin’s spray group were all lower than that of the model group (P ＜ 0.05 for 7 d, P ＜ 0.01 for 15 d). Furthermore, brain tissue pathomorphology was markedly improved, the content of SOD and ATPase were increased, while the content of MDA was significantly deceased in drug-treated group, when compared with the model group (P ＜ 0.01). Compared with treatment group for seven days, brain indexes and the content of ATPase in treatment group for 15 days were remarkably decreased (P ＜ 0.05), and the content of MDA was remarkably increased (P ＜ 0.05), with no significant difference found for SOD level.ConclusionBaicalin spray has protective effect on complete cerebral ischemia injury, possibly due to its free radical scavenging ability as well as and theimprovement of energy metabolism.

Brain ischemia; Free radical scavengers; Nootropic agents; BAICALIN; Animal experimentation

YANG Ming, Email: yangming16@126.com

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2011.06.012

國家“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項（2009ZX09103-353）

611137 成都中醫(yī)藥大學藥學院（史亞軍、施俊輝、劉劍云、唐梅、黃勤挽、楊明）；712046 咸陽，陜西中醫(yī)學院藥學院（史亞軍）；330004 南昌，江西中醫(yī)學院現(xiàn)代中藥制劑教育部重點實驗室（楊明）

楊明，Email：yangming16@126.com

2011-10-19

方法SD 大鼠隨機分為兩大組，即 A 組（給藥 7 d）與 B組（給藥 15 d），每大組分為 7 小組，即假手術組、模型組、貝加靈高劑量組、中劑量組、低劑量組、陽性對照組和空白乳劑組，每組 12 只。采用雙側(cè)動脈阻斷法建立大鼠全腦缺血模型，觀察大鼠腦組織病理形態(tài)學改變，測定大鼠腦指數(shù)，并利用分光光度法測定大鼠缺血腦組織均漿液中超氧化物歧化酶、丙二醛和 ATP 酶的含量。

結果與模型組相比，貝加靈高、中、低劑量組腦指數(shù)顯著降低（P＜ 0.05，P＜ 0.01）；給藥組腦組織病理形態(tài)顯著改善；腦組織 SOD 活力、ATP 酶含量顯著升高（P＜ 0.01），MDA 含量顯著降低（P＜ 0.01）；與治療 7 d 比較，治療15 d 的腦指數(shù)與 ATP 酶含量顯著降低（P＜ 0.05），MDA含量顯著升高（P＜ 0.05），SOD 水平則無明顯差異。

結論貝加靈噴霧劑對大鼠全腦缺血有一定修復保護作用，可能是通過抗自由基和改善能量代謝來發(fā)揮這一作用。

Author Affiliations:College of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, China (SHI Ya-jun, SHI Jun-hui, LIU Jian-yun, TANG Mei, HUANG Qin-wan, YANG Ming); College of Pharmacy, Shanxi University of Traditional Chinese Medicine, Xianyang 712046, China (SHI Ya-jun); Key Laboratory of Modern Preparation of TCM, Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine, Ministry of Education, Nanchang 330004, China (YANG Ming)

www.cmbp.net.cn Chin Med Biotechnol, 2011, 6(6):450-454