王帥，孟憲生，包永睿，郭小瑞

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，大連 116600)

北柴胡(Bupleurum chinense Dc.)為傘形科柴胡屬植物，是藥用柴胡的主要來源之一。其性微寒，味苦，具有和表解里、疏肝、升陽舉陷的功效，為中醫(yī)治療少陽證的首選藥物［1］。其所含主要有效成分為柴胡皂苷，具有保肝利膽、抗炎、鎮(zhèn)痛、抗?jié)?、抗菌、抗病毒、抗細菌?nèi)毒素等作用［2-3］。采用大孔吸附樹脂等技術(shù)對柴胡總皂苷類成分進行富集純化已有文獻報道，但均采用單一樹脂，且洗脫率不高。筆者采用樹脂聯(lián)用技術(shù)純化柴胡總皂苷，既可實現(xiàn)較高的洗脫率，又可保證較高的純度。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 1100 Series高效液相色譜儀(配有DAD、自動進樣器)，Chem Station(Agilent科技有限公司)，UV-1800紫外分光光度計(北京瑞利分析儀器公司)，CP225D型電子天平(德國Saritorius集團)。

1.2 試藥 柴胡皂苷A、D對照品(四川維克奇生物科技有限公司，批號:090312，090114)，柴胡藥材(遼寧本溪三藥有限公司提供，經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)翟延君教授鑒定為 Bupleurum chinense DC.)，大孔吸附與離子交換樹脂 HPD-300、HPD-400、HPD-600、D101、AB-8、NKA、NKA-9、D900(滄州寶恩化工有限公司)，其他化學(xué)試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 高效液相色譜法

2.1.1 色譜條件 色譜柱:Phenomenex C18(4.6 mm×250 mm，5μm);流動相:乙腈(A)-水(B);洗脫梯度(0～26 min:A 30%→42%;～40 min:A 42%);流速:1.0 mL·min-1;柱溫:25℃;檢測波長:210 nm。

2.1.2 對照品溶液的制備 精密稱取柴胡皂苷A 2.63 mg，柴胡皂苷 D 2.26 mg，置于 10 mL 量瓶中，加甲醇適量，超聲使溶解，再用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.1.3 標準曲線的繪制 精密量取柴胡皂苷A、D混合對照品溶液6，10，14，18，22，26，30 μL，按上述色譜條件進樣測定，以峰面積的自然對數(shù)為縱坐標，柴胡皂苷A(D)量的自然對數(shù)為橫坐標，繪制標準曲線，柴胡皂苷A 的回歸方程分別為:Y=93.624X －37.177，r=0.999 6;柴胡皂苷 D:Y=68.734X+38.675，r=0.999 1。表明柴胡皂苷A濃度在1.578～7.890 μg、柴胡皂苷D濃度在1.356 ～6.780 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2 紫外分光光度法

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取柴胡皂苷 A 5.53 mg，置于10 mL量瓶中，加甲醇適量，超聲使溶解，再用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.2 檢測波長的選擇 精密吸取柴胡皂苷A對照品溶液0.3 mL，置于10 mL具塞試管中，加甲醇至0.8 mL，加0.1%對二甲氨基苯甲醛乙醇溶液0.5 mL，70℃水浴10 min，后加入磷酸4.0 mL，70℃水浴5 min，放冷，于200～800 nm范圍內(nèi)進行全波長掃描。結(jié)果在541 nm處有最大吸收峰，故確定檢測波長為541 nm。

2.2.3 標準曲線的繪制 精密吸取對照品溶液0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8 mL，置于 10 mL 具塞試管中，加甲醇至0.8 mL，分別精密加入0.1%對二甲氨基苯甲醛乙醇溶液0.5 mL，搖勻，于70℃反應(yīng)10 min，取出，加入磷酸 4.0 mL［4］，70 ℃ 反應(yīng) 5 min，取出，放冷，于541 nm處測定吸光度(A值)。以A值為縱坐標，柴胡皂苷A的濃度(C，mg·mL-1)為橫坐標，繪制標準曲線，回歸方程為:A=12.425C －0.019 1，r=0.999 7(n=7)。表 明 柴胡 皂 苷 在 0.110 6 ～0.442 4 mg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3 柴胡總皂苷的富集與純化

2.3.1 供試液的制備 精確稱取柴胡藥材粉末100 g，10 倍量 90% 乙醇(含 2% 氫氧化鉀)［4］回流提取2次，第1次1.5 h，第2次1 h，過濾，濃縮，定容至250 mL量瓶中(0.4 g·mL-1)，稀鹽酸溶液調(diào)至中性，備用。另取柴胡藥材粉末100 g，同法提取，定容至1 000 mL量瓶中(0.1 g·mL-1)，稀鹽酸溶液調(diào)至中性，備用。

2.3.2 樹脂的預(yù)處理 選擇經(jīng)95%乙醇浸泡過夜的HPD-300、HPD-400、HPD-600、D101、AB-8、NKA、NKA-9等7種樹脂，濕法上柱，用95%乙醇洗脫，控制流速，待流出液與水1∶5混合不產(chǎn)生渾濁后，用大量純化水洗至無乙醇味，抽濾至干，備用［5］。

D900樹脂，經(jīng)3% ～5%鹽酸溶液洗至流出液呈酸性，去離子水洗至中性，3% ～5%氫氧化鈉溶液洗至流出液呈堿性，去離子水洗至中性，備用。

2.3.3 靜態(tài)吸附與解吸實驗(優(yōu)選樹脂) 準確稱取樹脂 HPD-300、HPD-400、HPD-600、D101、AB-8、NKA、NKA-9各5 g，置于50 mL錐形瓶中，加入0.4 g·mL-1樣品溶液30 mL。每隔10 min振搖20 s，2 h后吸取一定體積上清液［6］，HPLC法測定含量;樹脂抽濾至干，邊抽濾，邊用水100 mL洗滌樹脂，90%乙醇30 mL解吸，1 h后吸取一定體積解吸液，高效液相色譜(HPLC)法測定含量。結(jié)果見表1。飽和吸附量=［樣品中皂苷含量－解吸液中皂苷含量］/樹脂質(zhì)量;洗脫率(%)=洗脫量/飽和吸附量×100%;終得量=(飽和吸附量－洗脫量)×樹脂質(zhì)量。由表1可知，NKA-9型號樹脂的飽和吸附量與洗脫率均較高，皂苷的終得量最多，對柴胡皂苷的吸附及解吸性能較好，故確定NKA-9樹脂為最佳選擇。

2.3.4 動態(tài)吸附與解吸實驗［7］

2.3.4.1 泄露曲線 準確稱取處理好的NKA-9樹脂5 g，濕法裝于樹脂柱上，上樣100 mL(0.1 g·mL-1)，流速為2 BV·h-1，每10 mL接1管，共接9管，HPLC法測定含量。結(jié)果見圖1。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，柴胡皂苷A、D均在上樣量為40 mL時出現(xiàn)明顯泄露，故上樣量宜為30 mL，即1 g樹脂的藥材用量為0.6 g。

2.3.4.2 洗脫醇濃度考察 準確稱取處理好的NKA-9樹脂5 g，濕法裝于樹脂柱上，上樣30 mL(0.1 g·mL-1)，過柱液重新吸附一次，流速為 2 BV·h-1，5倍量(50 mL)水沖洗過后，依次用10%，30%，50%，70%，90%乙醇各30 mL洗脫，分別收集各洗脫液，每10 mL收集1份，HPLC法測定各洗脫液的柴胡皂苷A、D含量，繪制洗脫曲線。其中1～3號瓶為10%乙醇洗脫液，4～6號瓶為30%乙醇洗脫液，7～9號瓶為50%乙醇洗脫液，10～12號瓶為70%乙醇洗脫液，13～15號瓶為90%乙醇洗脫液，結(jié)果見圖2。由圖2可知，70%乙醇幾乎將全部柴胡皂苷A與D洗脫下來，故確定總皂苷洗脫醇濃度為70%乙醇。

2.3.4.3 洗脫醇用量考察 準確稱取處理好的NKA-9樹脂5 g，濕法裝于樹脂柱上，上樣30 mL(0.1 g·mL-1)，過柱液重新吸附一次，流速為2 BV·h-1，先用8倍量(80 mL)水除雜，再用3倍量(30 mL)30%乙醇除雜，后用9倍量(90 mL)70%乙醇洗脫，收集30%乙醇除雜液(1～3號)及70%乙醇洗脫液(4～12號)，每10 mL收集1份，共12份，HPLC法測定各樣品中柴胡皂苷A、D含量，繪制洗脫醇用量曲線。見圖3。由圖3可知，8倍量70%乙醇幾乎將全部柴胡皂苷A、D洗脫下來。故確定洗脫除雜方案為:8倍量水、3倍量30%乙醇除雜，8倍量70%乙醇洗脫。

2.3.5 離子交換樹脂 經(jīng)NKA-9大孔吸附樹脂純化后的70%乙醇洗脫液，以2 BV·h-1的流速直接經(jīng)過與吸附樹脂等量的D900離子交換樹脂脫色除雜，紫外分光光度法測定總皂苷含量，純度達70.3%。

3 討論

由靜態(tài)吸附實驗結(jié)果可知，大孔吸附樹脂的孔徑大小對柴胡皂苷的吸附量影響較大，而極性對其洗脫率影響較大。不同極性的 HPD300、HPD400、HPD600樹脂，孔徑較小，其飽和吸附量也相對較小;而其他孔徑相對較大的樹脂，其飽和吸附量也相對較大。同為極性的 HPD600、NKA-9樹脂，其洗脫率均較高，與NKA-9具有相似大小孔徑的NKA樹脂，由于其非極性，故洗脫率不如NKA-9。AB-8樹脂飽和吸附量最大，但洗脫率較小;HPD600洗脫率較大，但飽和吸附量并不大。綜合以上兩種影響因素，考慮其最終得量，故確定NKA-9樹脂為最佳選擇。

在對洗脫醇濃度考察時，10%與90%乙醇液中均不含所需成分，柴胡皂苷A在30%乙醇液中含量占5.32%，50%乙醇液中為 70.60%，70%乙醇液中為24.08%。柴胡皂苷 D在 30%乙醇液中含量占4.20%，50%乙醇液中為 44.46%，70%乙醇液中為51.35%。故確定總皂苷洗脫醇濃度為70%的乙醇。

在對洗脫醇用量考察時，3倍量30%乙醇洗脫液中含有柴胡皂苷A 4.26%和柴胡皂苷D 3.73%;6倍量70%乙醇可將94.01%柴胡皂苷A、88.41%柴胡皂苷D洗脫下來，7倍量70%乙醇可將95.18%柴胡皂苷A、93.06%柴胡皂苷D洗脫下來，而8倍量70%乙醇可將95.74%柴胡皂苷A、96.27%柴胡皂苷D洗脫下來。故確定采用8倍量70%乙醇洗脫，洗脫率＞95%。

在醇溶液的情況下直接上柱脫色是D900樹脂的優(yōu)點，既省略一些不必要的工序，又可減少有效成分的損失。經(jīng)NKA-9純化后的樣品，再經(jīng)D900離子交換樹脂脫色后，其純度達70.3%。

［1］肖功勝，楊云，孫維英，等.柴胡有效成分提取工藝的研究［J］.時珍國醫(yī)國藥，2008，19(8):1829.

［2］劉永春，叢培臣.柴胡的化學(xué)成分及藥理作用研究概況［J］.黑龍江醫(yī)藥，2006，19(3):216 －218.

［3］金順姬.柴胡的藥理作用及臨床應(yīng)用［J］.現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2009，25(7):1074 －1075.

［4］王鵬，王玉生，劉斌.不同產(chǎn)地柴胡中總皂苷及柴胡皂苷A 含量測定［J］.中國藥物與臨床，2008，8(3):228.

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