王 李，劉長劍，羅宗鍵

(1.大連市友誼醫(yī)院 醫(yī)學影像科，遼寧 大連 116001；2.大連醫(yī)科大學 附屬第一醫(yī)院 骨科，遼寧 大連 116011；3.長春中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院 骨科，吉林 長春 130021)

現(xiàn)已知多種理化因素能參與影響體內(nèi)、外成骨過程的各個環(huán)節(jié)。各種因素在此過程中并非只是單獨調(diào)節(jié)骨形成或骨吸收，而是對骨吸收和骨形成在不同的組織。不同的時間段起不同的作用，經(jīng)綜合、交叉作用后共同完成對成骨的調(diào)節(jié)。體外沖擊波(extracorporeal shock wave,ESW)對成骨細胞的作用引人注目。ESW可以一種機械能的形式進入骨折部位，骨組織對高頻率、低強度的機械刺激敏感。而低能量的ESW正好可持續(xù)給予骨折部位的骨組織這種應力刺激。大量研究證明，頻率、能量強度適合的ESW可促進骨愈合[1,2]。成骨細胞的體內(nèi)環(huán)境中，由于液體流動、活體運動等因素，也是處于持續(xù)的應力刺激之下。有文獻報道，PKC和p38MAPK蛋白激酶家族成員可能與成骨細胞增殖、成骨功能密切相關[3,4]。所以，本研究觀察ESW這一應力刺激因素對體外培養(yǎng)鼠成骨細胞(ROB)增殖分化的影響，并進一步探討了ESW作用的細胞內(nèi)信號傳導過程中PKC和p38MAPK的可能作用。

1 材料和方法

1．1 實驗材料

動物和試劑：出生24 h內(nèi)Wistar大鼠乳鼠(大連醫(yī)科大學實驗動物中心，雌雄不拘，清潔級)72只，每次取6只顱蓋骨成骨細胞分瓶培養(yǎng)、擴增至第3代備用。PI染液、RNA酶(北京鼎國生物技術(shù)公司)，ALP活性檢測試劑盒(南京建成公司)，兔抗鼠I型膠原免疫組化試劑盒(武漢博士德公司)，高糖DMEM培養(yǎng)基(美國Hyclone公司)，胎牛血清(杭州四季青公司)，H7 (美國sigma生物)，SB203580(美國sigma生物)，細胞全蛋白提取試劑盒(凱基生物)，蛋白定量試劑盒(凱基生物)，磷酸化P38 MAPK一抗(美國Santa Cruze生物)，總P38 MAPK一抗(美國Santa Cruze生物)ECL放射顯影試劑盒(美國Amershan生物)，其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

主要儀器和設備：體外沖擊波碎石機(MODEL KDE-2001A，北京中科建安公司)，流式細胞儀(B.D.FACS Aria，美國B.D.公司)，恒溫二氧化碳培養(yǎng)箱(Series Ⅱ Water Jacketed CO2 Incubator，美國Thermo Electron公司)，超凈工作臺(Forma Class Ⅱ A2 Biological Safety Cabinet，美國Thermo Electron公司)，立式滅菌器(LMQ.R-4060，山東新華醫(yī)療儀器公司)Western Blot 放射顯影曝光暗室及洗片機，電泳儀(EC120 Mini Vertical Gel System，美國Thermo Electron)。

1.2 實驗方法

細胞培養(yǎng)，取出生24 h內(nèi)Wistar大鼠乳鼠，浸泡于75%酒精中5～10 min，取出顱骨，沖洗后用0.1%I型膠原酶消化20 min，吸棄上清，用眼科手術(shù)剪將骨塊剪碎，再用0.1%I型膠原酶消化30 min，終止消化，再次加入0.1%I型膠原酶消化30 min，重復消化共3次，將獲得的細胞懸浮于含10%胎牛血清的DMEM中，接種培養(yǎng)，細胞長致融合狀態(tài)時消化傳代(1∶2)，詳見作者報道的方法[5]。

1．3 觀察ESW對體外培養(yǎng)ROB的影響

將MODEL KDE-2001 體外液波碎石機調(diào)整形成能量密度為0.18 mJ/mm2的低能沖擊波。取體外培養(yǎng)第3代ROB，ESW沖擊之前將ROB培養(yǎng)于不含血清的培養(yǎng)基中24 h，使培養(yǎng)的細胞同步化；將目標細胞裝入細胞凍干瓶中然后通過C型臂X 射線透視裝置將凍干瓶定位在半橢圓形的第2焦點處。用該能量的沖擊波分別作用含有ROB細胞懸液(5×105/mL)的細胞凍存管0、30、60、90、120、150次，每組設3個樣本。

1.3.1 ROB細胞增殖觀察

(1)臺盼蘭染色法活細胞計數(shù)，取體外培養(yǎng)第3代成骨細胞，加入臺盼蘭染液后滴入細胞計數(shù)池，顯微鏡下計數(shù)活細胞數(shù)目。

(2)MTT(噻唑蘭)法檢測細胞增殖：取第3代成骨細胞，分組刺激后，按照常規(guī)MTT法將細胞培養(yǎng)于含10%去類固醇FBS的高糖DMEM中48 h；然后將培養(yǎng)液棄去，每孔加入MTT應用液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，每孔加入150 μL二甲基亞砜(DMSO)孵育20 min。調(diào)整酶標儀波長為490nm，測定每孔吸光度。

(3)流式細胞術(shù)(FCM)進行DNA倍體分析檢測ROB增殖指數(shù)：取第3代成骨細胞，分組刺激后，培養(yǎng)于含10%去類固醇FBS的高糖DMEM中24 h。收集細胞，離心棄培養(yǎng)液，70%乙醇固定，置4℃冰箱過夜。檢測前加RNA酶溶解RNA，加PI染液，避光孵育30 min，按試劑盒說明上機檢測。用Modfit分析軟件分析圖像，得出處于各個細胞周期的細胞比例，計算ROB細胞增殖指數(shù)(PI指數(shù))：PI=S%+G2%

1.3.2 ROB成骨分化觀察

(1)酶標儀檢測ROB細胞內(nèi)ALP活性：取第3代成骨細胞，分組刺激，將細胞懸浮于含10%去類固醇FBS的高糖DMEM中，調(diào)整細胞濃度為2×104/ mL，加入96孔板，培養(yǎng)于37℃、5%CO2和飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)72 h。按試劑盒操作步驟處理96孔板中的細胞，在405 nm波長下測定各孔的吸光度。

按如下公式計算樣品中堿性磷酸酶(ALP)活性：

ALP活性(金氏單位/100 mL)=(測定管吸光度/標準管吸光度)×0.005×(100/0.05)

(2)免疫組化法檢測I型膠原表達：取第3代成骨細胞，分組刺激后，將細胞懸浮于含10%去類固醇FBS的高糖DMEM中，調(diào)整細胞濃度為2×104/ mL，接種于24孔板中進行細胞爬片4 d；將爬片固定后，按免疫組化劑盒說明步驟操作；顯微鏡觀察并計數(shù)陽性細胞百分比。

1．4 探討ESW作用于成骨細胞的細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導機制

取體外培養(yǎng)第3代ROB，ESW沖擊之前將ROB培養(yǎng)于不含血清的培養(yǎng)基中24 h，使培養(yǎng)的細胞同步化，收集細胞，分組如下：

對照組：單純0.18 mJ/mm2ESW沖擊120次組；ESW+H7組：刺激前1 h加入PKC抑制劑H7(2×10-5M)；ESW+SB203580組：刺激前1 h加入p38MAPK抑制劑SB203580(2×10-5M)。

觀察指標：(1)臺盼蘭染色法活細胞計數(shù)；(2) MTT法檢測細胞增殖；(3) FCM進行DNA倍體分析檢測ROB增殖指數(shù)；(4)酶標儀檢測ROB細胞內(nèi)ALP活性；(5) 免疫組化法檢測I型膠原表達；(6) Western Blot檢測ESW是否磷酸化激活p38MAPK，以及PKC抑制劑H7和p38MAPK抑制劑SB203580對ESW磷酸化激活p38MAPK的影響。

1．5 統(tǒng)計學方法

2 結(jié) 果

2.1 ESW對體外培養(yǎng)ROB的影響

2.1.1 ROB細胞增殖觀察結(jié)果

(1)臺盼蘭染色法活細胞計數(shù)：細胞數(shù)量隨著0.18 mJ/mm2ESW刺激次數(shù)從30～120次之間依次增加。細胞計數(shù)在ESW刺激30～150次各組比較差異有顯著性意義(P<0.05)，陰性對照組(0次)與ESW 30次組之間比較差異無顯著性意義(P>0.05)，見表1。

(2) MTT法檢測細胞增殖：A490值隨著0.18 mJ/mm2ESW刺激次數(shù)從30～120次之間依次增加。A490值在ESW刺激30～150次各組之間差異有顯著性意義(P<0.05)，除了ESW 90次和150次刺激組之間差異無顯著性意義、陰性對照和ESW30次組之間差異無顯著性意義之外，見表1。

(3) FCM進行DNA倍體分析檢測ROB增殖指數(shù)(PI)：PI隨著0.18 mJ/mm2ESW刺激次數(shù)從30～120次之間依次增加。PI值在ESW刺激30～150次各組之間差異有顯著性意義(P<0.05)，除了ESW120次和150次刺激組之間差異無顯著性意義、陰性對照和ESW30次組之間差異無顯著性意義之外，見表1。

2.1.2 ROB成骨分化觀察結(jié)果

(1)酶標儀檢測ROB細胞ALP活性：ALP活性隨著0.18 mJ/mm2ESW刺激次數(shù)從30～120次之間依次增加。ALP活性在ESW刺激30～150次各組之間差異有顯著性意義(P<0.05)，除了ESW90次和150次刺激組之間差異無顯著性意義、陰性對照和ESW30次組之間差異無顯著性意義之外，見表1。

(2)免疫組化法檢測I型膠原表達：I型膠原陽性ROB細胞百分比隨著0.18 mJ/mm2ESW刺激次數(shù)從30～150次之間依次增加。I型膠原陽性ROB細胞百分比在ESW刺激30～150次各組之間差異有顯著性意義(P<0.05)，除了ESW120次和150次刺激組之間差異無顯著性意義、陰性對照和ESW30次組之間差異無顯著性意義之外，見表1。

表1 不同沖擊次數(shù)0.18 mJ/mm2ESW刺激對ROB增殖的影響

1) 與對照組相比，P<0.05；2) 與對照組相比，P<0.01；n=3

2．2 ESW作用于成骨細胞的細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導機制的探討結(jié)果

2.2.1 ROB細胞增殖觀察結(jié)果

觀察PKC抑制劑H7和p38MAPK抑制劑SB203580對120次0.18 mJ/mm2ESW刺激促進體外培養(yǎng)ROB細胞增殖作用的影響：

(1)臺盼蘭染色法活細胞計數(shù)：120次ESW刺激組細胞數(shù)量最高，PKC抑制劑H7和p38MAPK抑制劑SB203580均能顯著抑制120次ESW刺激組的細胞數(shù)目，其各組細胞數(shù)目比較差異有顯著性意義(P<0.05)，PKC和p38MAPK均參與ESW促進ROB細胞增殖的作用，見表2。

(2) MTT法檢測細胞增殖：120次ESW刺激組A490值最高，PKC抑制劑H7和p38MAPK抑制劑SB203580均能顯著降低120次ESW刺激組的A490值，其各組A490值比較差異有顯著性意義(P<0.05)，PKC和p38MAPK均參與ESW促進ROB細胞增殖的作用，見表2。

(3) FCM進行DNA倍體分析檢測ROB增殖指數(shù)，120次ESW刺激組增殖指數(shù)PI值最高，PKC抑制劑H7和p38MAPK抑制劑SB203580均能顯著抑制120次ESW刺激組的PI指數(shù)，其各組PI指數(shù)比較差異有顯著性意義(P<0.05)，PKC和p38MAPK均參與ESW促進ROB細胞增殖的作用，見表2。

表2 PKC抑制劑H7和p38MAPK抑制劑SB203580對120次0.18 mJ/mm2ESW刺激促進ROB成骨分化作用的影響

1)與各自相應的無抑制劑H7或SB203580加入組比較,P<0.01；2)與H7加入組比較,P<0.05；n=3

2.2.2 ROB成骨分化觀察結(jié)果

觀察PKC抑制劑H7和p38MAPK抑制劑SB203580對120次0.18 mJ/mm2ESW刺激促進體外培養(yǎng)ROB細胞成骨作用的影響：

(1)酶標儀檢測ROB細胞ALP活性：120次ESW刺激組ALP活性最高，PKC抑制劑H7和p38MAPK抑制劑SB203580均能顯著降低120次ESW刺激組的ALP活性，其各組ALP活性比較差異有顯著性意義(P<0.05)，PKC和p38MAPK均參與ESW促進ROB細胞成骨的作用，見表2。

(2)免疫組化法檢測I型膠原表達：120次ESW刺激組I型膠原表達陽性細胞比率最高，PKC抑制劑H7和p38MAPK抑制劑SB203580均能顯著降低120次ESW刺激組的I型膠原表達陽性細胞比率，其各組之間比較差異有顯著性意義(P<0.05)，PKC和p38MAPK均參與ESW促進ROB細胞成骨的作用，見表2。

2.2.3 Western Blot檢測結(jié)果

Western Blot檢測ESW是否磷酸化激活p38MAPK，以及PKC抑制劑H7和p38MAPK抑制劑SB203580對ESW磷酸化激活p38MAPK的影響，來探討ESW對ROB作用的細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導通路：可見120次ESW刺激組磷酸化p38MAPK表達的光密度比最高，其磷酸化激活p38MAPK的能力最強，PKC抑制劑H7和p38MAPK抑制劑SB203580均能顯著降低120次ESW刺激的這種作用，其各組之間比較差異有顯著性意義(P<0.05)，PKC位于ESW促進ROB增殖成骨作用細胞信號通路的上游(圖1)。

圖1 Western Blot檢測P-p38MAPK表達

3 討 論

適當?shù)膽Υ碳た梢源龠M體內(nèi)、外成骨。因而，近來在骨組織工程構(gòu)建方式上提出應力化、持續(xù)灌流構(gòu)建的概念[6-10]。多個關于ESW的研究證實，ESW可以使作用部位的流體力學狀態(tài)改變并對處于作用范圍中的細胞產(chǎn)生流體剪切應力(FSS)和牽拉作用[11,12]；成骨細胞和骨細胞一直被認為是主要的應力感受細胞。本實驗數(shù)據(jù)表明0.18 mJ/mm2ESW(60～150次)刺激可顯著促進ROB增殖和成骨分化。

在人體環(huán)境中，成骨細胞處于持續(xù)不斷的應力刺激之下，這種作用會對ROB增殖、分化造成什么影響。本研究根據(jù)前期實驗數(shù)據(jù)，采用0.18 mJ/mm2ESW(30～150次)刺激共同作用于體外培養(yǎng)的ROB(為盡量排除血液中其他活性成分的干擾，實驗過程中采用去類固醇血清)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)， 0.18 mJ/mm2ESW(60～150次)刺激各組能明顯促進ROB體外增殖和成骨分化。體內(nèi)骨質(zhì)的溶解和重塑是處在一個動態(tài)

平衡之中，這種動態(tài)平衡又依賴于成骨細胞(OB)和破骨細胞(OC)功能之間的平衡[13,14]。本實驗結(jié)果表明，ESW刺激可以促進成骨細胞的增殖、分化，這也有助于解釋為什么體育鍛煉可以促進骨質(zhì)形成；而且，PKC和p38MAPK這兩種應力敏感蛋白激酶可能都參與此過程的信號傳導，PKC可能作用于p38MAPK的上游。通過上述實驗，可得出如下設想：在體內(nèi)環(huán)境中，骨吸收和骨形成保持平衡；如果出現(xiàn)抑制骨形成、促進骨吸收的因素，如長期臥床等情況，這一平衡會向骨質(zhì)吸收傾斜，出現(xiàn)骨質(zhì)疏松等表現(xiàn)；如果出現(xiàn)促進骨形成、抑制骨吸收的因素，如體育鍛煉等適當?shù)膽Υ碳ぃ@一平衡會向骨質(zhì)形成傾斜。雖然適當?shù)膽Υ碳け挥^察到可通過PKC和p38MAPK促進體外培養(yǎng)的ROB增殖、成骨分化，但其作用的分子機制遠未明了，尚需進一步研究。

本研究結(jié)果提示，適當?shù)腅SW應力刺激可明顯促進體外培養(yǎng)ROB增殖和成骨分化，PKC和p38MAPK可能都參與此過程的細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導，PKC可能位于其細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導通路的上游。

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