蘇福海 全 燦 王海峰 李紅梅

(中國計(jì)量科學(xué)研究院，化學(xué)計(jì)量與分析科學(xué)研究所，北京 100013)

諾龍(Nandrolone)是蛋白同化雄性類固醇藥物，活性較為顯著[1-3]，既能增強(qiáng)從氨基酸合成蛋白質(zhì)，又能抑制氨基酸分解生成尿素，并有促進(jìn)體內(nèi)鈣質(zhì)蓄積的功能。其同化作用較其它睪丸素類衍生物強(qiáng)大而持久，而其男性激素作用卻較小。2008年世界反興奮劑機(jī)構(gòu)(WADA)公布的《禁用物質(zhì)清單》列舉的蛋白同化制劑主要包括諾龍等9種蛋白同化類固醇類興奮劑[4，5]。目前國內(nèi)還沒有諾龍的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)用于檢測(cè)，因此為了能夠支持動(dòng)物源性食品中違禁藥物的檢測(cè)分析，確保檢測(cè)結(jié)果的可靠性、可比性和溯源性[6，7]，筆者研究了諾龍甲醇溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備。由于一切測(cè)量結(jié)果不可避免地具有不確定度[8]，而化學(xué)分析者使用的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)量值的準(zhǔn)確性以及不確定度水平是影響分析結(jié)果的一個(gè)重要的因素。為此筆者分析了標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值過程中的不確定度來源[9]，并對(duì)不確定度進(jìn)行了評(píng)定。

1 諾龍純品原料定性分析

所需純品原料主要采用市售產(chǎn)品，諾龍(純度大于99%，美國Fluka公司)經(jīng)真空包裝密封儲(chǔ)存在保干器并冷藏于4℃冰箱中，甲醇試劑為色譜純(純度大于99.8%，美國Riedel-de-Haen公司)。

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀:LC-20A型，日本島津公司；

Inertsil ODS-SP色譜柱:250 mm×4.6 mm, 5 μm ，日本GL科學(xué)儀器公司；

紅外光譜儀：AVATAR 330FT-IR型，美國Thermo Nicolet公司。

1.2 液相色譜-質(zhì)聯(lián)法分析

圖1為諾龍的液相色譜-質(zhì)聯(lián)法(LC-MS)譜圖，由圖1可以看出分子離子峰(M+H)+的質(zhì)荷比m/z為275.2，是諾龍分子量(274.4)與氫原子量(1.0)之和，因此可以初步對(duì)諾龍定性。

圖1 諾龍?jiān)系腖C-MS譜圖

1.3 紅外光譜法分析

諾龍純品原料和諾龍標(biāo)準(zhǔn)的紅外光譜分別如圖2、圖3所示，通過比較圖2和圖3可知，諾龍純品原料紅外光譜圖與諾龍標(biāo)準(zhǔn)紅外光譜圖一致，可以確認(rèn)純品原料為諾龍。

圖2 諾龍?jiān)霞兤返募t外光譜圖

圖3 諾龍標(biāo)準(zhǔn)紅外光譜圖

2 諾龍純品原料純度定值

純品原料中主成分定值方法參照國際上各個(gè)國家計(jì)量實(shí)驗(yàn)室通用方法。高純有機(jī)化合物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值方案，國外最早形成于20世紀(jì)70年代，對(duì)純度為99%以上的化合物，通常選擇高效液相色譜(HPLC)歸一化法對(duì)其純度進(jìn)行定值[10-12]。因此采用多家實(shí)驗(yàn)室聯(lián)合定值的方法，共有7家實(shí)驗(yàn)室參與，每家實(shí)驗(yàn)室發(fā)放7瓶樣品，其中1瓶提供7個(gè)純度值，其余6瓶各給出3個(gè)純度值。選擇以下色譜條件：流動(dòng)相為水(含0.1% HAc)-乙腈(體積比為50∶50)等度洗脫，流速為1.0 mL/min；色譜柱：Inertsil ODS-SP柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm)；進(jìn)樣量：5 μL(1.00 mg/mL的諾龍甲醇溶液)；監(jiān)測(cè)波長：220、230、235、242、250、260 nm；定值波長：242 nm。

表1 諾龍純度多家合作定值結(jié)果 %

對(duì)表1數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)，結(jié)果列于表2。

表2 統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)結(jié)果

3 諾龍甲醇溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制備

諾龍甲醇溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是采用重量法精確制備，方法如下：使用經(jīng)過檢定合格的分析天平(分度0.1 mg)準(zhǔn)確稱量經(jīng)過純度分析的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)原料純品300～500 mg,轉(zhuǎn)移溶質(zhì)于準(zhǔn)確稱重過的潔凈錐形瓶中。在另一個(gè)分析天平(分度0.01 g)，加入一定質(zhì)量的甲醇至錐形瓶中，所需的甲醇質(zhì)量根據(jù)甲醇的密度0.791 g/mL和擬配制的諾龍?bào)w積濃度計(jì)算得出。精確稱量所加入甲醇的質(zhì)量，充分混勻，制得諾龍甲醇溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，濃度為1.00 mg/mL。

利用重量法配制了200瓶以上濃度為1.00 mg/mL的諾龍甲醇溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，使用液相色譜法對(duì)所配制溶液進(jìn)行核驗(yàn)，核驗(yàn)結(jié)果列于表3。

表3 甲醇溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)

注：甲醇密度 (20℃) 為0.791 g/mL。

4 諾龍甲醇溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均勻性檢驗(yàn)

根據(jù)JJG 1006-1994《一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)技術(shù)規(guī)范》的要求對(duì)研制的溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行均勻性檢驗(yàn)。具體抽樣檢驗(yàn)方法為：從每種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中隨機(jī)抽取11瓶，進(jìn)行瓶間均勻性檢驗(yàn)；再取任意一瓶，取7個(gè)子樣，進(jìn)行瓶內(nèi)均勻性檢驗(yàn)(采用HPLC法測(cè)定)，檢驗(yàn)結(jié)果見表4。對(duì)表4數(shù)據(jù)進(jìn)行F檢驗(yàn)和t檢驗(yàn)，證明標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)瓶內(nèi)和瓶間樣品均勻一致[13]。

表4 諾龍甲醇溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均勻性檢驗(yàn)結(jié)果

5 諾龍甲醇溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)穩(wěn)定性檢驗(yàn)

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)穩(wěn)定性考察按先密后疏的原則，在一定時(shí)間間隔內(nèi)選擇定值方法即液相色譜法，檢測(cè)在規(guī)定條件下保存的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度隨時(shí)間的變化情況，通常分別在第1、2、3、6個(gè)月進(jìn)行穩(wěn)定性監(jiān)測(cè)。每次取5個(gè)包裝，每個(gè)包裝取一個(gè)子樣，檢測(cè)3次，計(jì)算平均值，把5個(gè)包裝測(cè)量結(jié)果平均值作為檢測(cè)結(jié)果，檢驗(yàn)結(jié)果列于表5。實(shí)驗(yàn)證明諾龍溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在監(jiān)測(cè)期間內(nèi)是穩(wěn)定的。

表5 諾龍溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)穩(wěn)定性考察

6 諾龍甲醇溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值不確定度評(píng)定

6.1 液相色譜法純度定值引入的不確定度

(1)液相色譜法定值測(cè)量重復(fù)性引入的不確定度u1=0.01%；

(2)各組分在不同檢測(cè)波長下響應(yīng)差異引入的不確定度u2

綜合考慮主成分和雜質(zhì)化合物在相應(yīng)檢測(cè)波長下的響應(yīng)，各組分引入的不確定度u2-i采用以下公式進(jìn)行量化：

純度定值標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

uLC,rel=0.03%/99.64%=0.03%

6.2 合作定值結(jié)果的不確定度

液相色譜合作定值產(chǎn)生的不確定度列于表6。

表6 液相色譜法合作定值結(jié)果不確定度

根據(jù)表5，u多家，rel=0.07%/99.64%=0.07%

6.3 溶液制備過程引入的不確定度

(1)天平稱量引入不確定度

天平稱量不確定度主要來源于天平稱量最大允許誤差、天平稱量變動(dòng)性、浮力影響 (在常規(guī)狀態(tài)下稱重，此項(xiàng)可忽略)。

純品原料稱量使用0.1 mg分度的分析天平，天平的變動(dòng)性、檢定誤差等估計(jì)為0.05 mg，稱樣量為400 mg，按矩形分布，相對(duì)不確定度為0.007%。

甲醇的稱量使用0.01 g分度的分析天平，天平的變動(dòng)性、檢定誤差等估計(jì)為0.01 g，稱樣量為300 g，按矩形分布，相對(duì)不確定度為0.002%。

(2)溫度對(duì)體積的影響引入的不確定度

因此，諾龍溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)配制引入的相對(duì)不確定度為：

6.4 諾龍甲醇溶液核驗(yàn)引入的不確定度

利用重量法配制了濃度為1.00 mg/mL的諾龍甲醇溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，使用液相色譜法對(duì)所配制溶液進(jìn)行了核驗(yàn)，以其7次重復(fù)測(cè)量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD計(jì)入結(jié)果不確定度評(píng)定中，經(jīng)計(jì)算,u核驗(yàn),rel=0.14%。

6.5 合成相對(duì)不確定度

取k=2,則相對(duì)擴(kuò)展不確定度為:

U=0.38%×2≈1.0 %

諾龍溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)濃度為1.00 mg/mL時(shí)，相對(duì)擴(kuò)展不確定度為1.0% (k=2)。

7 結(jié)語

采用紅外光譜、質(zhì)譜法對(duì)純度大于99%的諾龍市售產(chǎn)品經(jīng)定性分析后，利用HPLC面積歸一化方法對(duì)諾龍?jiān)霞兌冗M(jìn)行定值；利用重量法配制濃度為1.00 mg/mL的諾龍甲醇溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，并進(jìn)行了均勻性、穩(wěn)定性檢測(cè)；對(duì)濃度定值結(jié)果進(jìn)行了不確定評(píng)定。所研制的諾龍溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，對(duì)于保證檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室測(cè)量結(jié)果的準(zhǔn)確可靠與互認(rèn)、避免在食品檢測(cè)中出現(xiàn)“測(cè)不準(zhǔn)”問題具有重要意義。

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