徐彥輝 顧 亮 蔣俊樹(shù) 丁 磊

(國(guó)家農(nóng)副加工食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，安徽國(guó)家農(nóng)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化與監(jiān)測(cè)中心，合肥 230051)

孔雀石綠(MG)為三苯甲烷類工業(yè)染料，同時(shí)還是一種有效的殺滅霉菌的染料類藥物，對(duì)真菌和寄生蟲(chóng)有較好的殺滅效果，在水產(chǎn)業(yè)得到了廣泛應(yīng)用?？兹甘G是3個(gè)芳香胺的聚合物，存在潛在致癌、致畸、致突變作用。自1980年發(fā)現(xiàn)孔雀石綠具有潛在的致癌性, 美國(guó)、日本以及英國(guó)等許多國(guó)家已禁止其用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)。中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY5071-2002《無(wú)公害食品漁用藥物使用準(zhǔn)則》中已將孔雀石綠列為禁用藥物。但是由于孔雀石綠效高價(jià)廉、管理力度不夠、替代品少等原因，使得不少漁民還在小范圍使用，這不可避免地帶來(lái)其在水產(chǎn)品中的殘留問(wèn)題和環(huán)境污染問(wèn)題[1]。有文獻(xiàn)報(bào)道孔雀石綠進(jìn)入養(yǎng)殖水體后，除了進(jìn)入魚(yú)體還會(huì)有一部分殘留在水中。另外，孔雀石綠作為工業(yè)染料而產(chǎn)生的廢水有可能通過(guò)相關(guān)渠道進(jìn)入養(yǎng)殖水體系，污染水體。近年來(lái)我國(guó)因藥物殘留，出口的動(dòng)物源性食品禁運(yùn)現(xiàn)象經(jīng)常發(fā)生。孔雀石綠作為一種禁用藥物，需要開(kāi)發(fā)出一種靈敏可靠的檢測(cè)方法來(lái)監(jiān)控其使用情況，這不僅局限于水產(chǎn)品本身，對(duì)養(yǎng)殖環(huán)境中的孔雀石綠的監(jiān)控同樣極其重要。總之，隨著對(duì)水產(chǎn)品質(zhì)量安全重視，對(duì)有害有毒物質(zhì)的監(jiān)控越來(lái)越多，要求也越來(lái)越嚴(yán)格，無(wú)論是從對(duì)孔雀石綠在水產(chǎn)品中使用的監(jiān)控還是對(duì)養(yǎng)殖水體間接污染物的監(jiān)測(cè)，都有必要建立一種水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中孔雀石綠的檢測(cè)方法。

目前國(guó)內(nèi)有關(guān)孔雀石綠的研究報(bào)道主要集中在水產(chǎn)品中，對(duì)養(yǎng)殖水體中的殘留檢測(cè)報(bào)道較少。筆者建立了一種簡(jiǎn)便、高效、準(zhǔn)確，適用于檢測(cè)水樣中痕量孔雀石綠及其代謝物的方法，為水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境提供可行的監(jiān)測(cè)手段，同時(shí)可為水體中孔雀石綠檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)的制定提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀：6410 Triple Quad LC/MS型，美國(guó)安捷倫公司；

離心機(jī)： Z-323 K型，德國(guó)哈默公司；

超聲波清洗器：KQ5200 DE型，昆山市超聲儀器有限公司；

混勻器： IKA MS 3basic，德國(guó)IKA公司；

甲醇、乙腈、乙酸、甲酸：色譜純，美國(guó)TEDIA公司；

顯性孔雀石綠(MG)和隱性孔雀石綠(LMG)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：1 mg/L，用乙腈配制，根據(jù)需要用流動(dòng)相將混合中間標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋成適合濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用；

試驗(yàn)用水為美國(guó)Milli-Q去離子水發(fā)生器制備的高純水。

1.2 樣品前處理

準(zhǔn)確量取20 mL養(yǎng)殖水樣于50 mL具塞離心管中，以5 000 r/min離心5 min，除去部分雜質(zhì)，將上清液轉(zhuǎn)移至另一50 mL具塞離心管中用乙酸調(diào)節(jié)至pH (3±0.2)，將酸化后的水樣全部轉(zhuǎn)移至已活化的PCX (60 mg,3 mL)固相萃取柱(使用前用3 mL乙腈，3 mL 2%甲酸水溶液活化)，控制流速不超過(guò)0.5 mL/min，將上清液全部過(guò)柱，依次用3 mL 2%甲酸水溶液淋洗、3 mL 水淋洗，棄去淋洗液并將小柱抽干，用3 mL乙酸乙酯-甲醇-氨水(體積比為50∶45∶5)洗脫，收集洗脫液于50℃水浴中氮?dú)獯蹈?，?zhǔn)確加入1 mL流動(dòng)相，渦旋混勻30 s后，經(jīng)0.22 μm濾膜后供儀器檢測(cè)。

1.3 儀器分析條件

(1)液相色譜條件

色譜柱：Eclipse XDB-C18柱(100 mm×2.1 mm, 5 μm)；柱溫：35℃；流速：0.30 mL/min；進(jìn)樣量：5 μL；流動(dòng)相：5 mmol/L乙酸銨-乙腈(體積比3∶1)，等度洗脫。

(2)質(zhì)譜分析條件

離子源：電噴霧離子源(ESI+)；掃描方式：正離子掃描；檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)；干燥氣溫度：350 ℃；干燥氣流速：10 L/min；霧化器壓力：276 kPa (40 Psi)；毛細(xì)管電壓：3 500 V；碰撞電壓以及相應(yīng)的定性離子對(duì)、定量離子對(duì)、保留時(shí)間及碰撞能量見(jiàn)表1。

表1 多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)條件

2 結(jié)果與討論

實(shí)驗(yàn)研究對(duì)象為養(yǎng)殖水樣，成分相對(duì)簡(jiǎn)單，油脂、色素含量較少，因此實(shí)驗(yàn)省去了相關(guān)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中先使用中性氧化鋁除脂步驟，而選擇了將養(yǎng)殖水樣離心后采用固相萃取方法，富集水樣中的孔雀石綠供色譜分析。為了選擇合適的固相萃取條件，要分析研究對(duì)象的相關(guān)性質(zhì)?？兹甘G在水體中有顯性孔雀石綠和隱性孔雀石綠兩種存在形式。顯性孔雀石綠為極性物質(zhì)，易溶于水，在水體中多以陽(yáng)離子形式存在，而隱性孔雀石綠極性較弱，易溶于有機(jī)溶劑[2]。結(jié)合目標(biāo)物有不同的極性,實(shí)驗(yàn)選擇了混合陽(yáng)離子固相萃取柱(PCX)，它兼有陽(yáng)離子交換和反相萃取性質(zhì)，適合本實(shí)驗(yàn)中目標(biāo)物的富集分析。

孔雀石綠對(duì)光、熱和氧氣較敏感，易發(fā)生去甲基化和氧化降解，且孔雀石綠(pKa=6.9)分子結(jié)構(gòu)中有兩個(gè)氨基，在酸性條件下易形成陽(yáng)離子，結(jié)合固相萃取條件的優(yōu)化可知pH值在實(shí)驗(yàn)中是關(guān)鍵因素，影響到富集和洗脫的效果。因此實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)將pH值對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響進(jìn)行了研究探討。

2.1 不同酸性條件下的回收率

孔雀石綠的pKa=6.9，根據(jù)陽(yáng)離子固相萃取條件的選擇，為了保證上樣時(shí)孔雀石綠帶上正電荷，理論上pH值要小于pKa兩個(gè)單位以上[3]。試驗(yàn)比較不同pH值為3、4、5、6.7條件下孔雀石綠的回收率。從試驗(yàn)結(jié)果可知，隨pH值的增大，孔雀石綠的回收率降低，這可能是孔雀石綠在不同酸性條件下形成陽(yáng)離子的能力差異影響到了固相萃取效果。實(shí)驗(yàn)最終選擇了使用乙酸調(diào)節(jié)養(yǎng)殖水樣至pH 3，在此酸性條件下孔雀石綠的回收率最高。

2.2 洗脫溶劑的選擇

固相萃取條件優(yōu)化過(guò)程中，洗脫液的選擇至關(guān)重要。同樣根據(jù)陽(yáng)離子固相萃取條件的選擇，為了保證洗脫時(shí)中和孔雀石綠所帶電荷，理論上pH值要大于pKa兩個(gè)單位。在參考相關(guān)文獻(xiàn)[4,5]的基礎(chǔ)上，首先選擇了氨水甲醇作為洗脫液，研究發(fā)現(xiàn)不同濃度(1%、2%、3%、4%、5%)的氨水甲醇溶液的回收率不高，因此又對(duì)洗脫液進(jìn)行了優(yōu)化，研究發(fā)現(xiàn)加入一定量的乙酸乙酯后，孔雀石綠的回收率達(dá)到了70%以上。對(duì)不同濃度的乙酸乙酯-甲醇-氨水(體積比50∶49∶1、50∶48∶2、50∶47∶3、50∶46∶4、50∶45∶5)的回收試驗(yàn)表明，乙酸乙酯-甲醇-氨水的體積比為50∶45∶5時(shí)回收率最高。

2.3 儀器條件的選擇

在LC-MS/MS分析中，色譜的分離和質(zhì)譜數(shù)據(jù)的采集是同時(shí)進(jìn)行的。為了使每個(gè)組分都得到分離和鑒定，以獲得最大的靈敏度，必須設(shè)置合適的色質(zhì)分析條件，特別是質(zhì)譜條件。

色譜條件包括色譜柱類型、流動(dòng)相組成、流動(dòng)相大小、柱溫等。質(zhì)譜條件包括離子源、離子化模式、離子源溫度、霧化氣流量、質(zhì)量掃描范圍、定量檢測(cè)模式等，這些都要根據(jù)樣品情況進(jìn)行設(shè)定，優(yōu)化的儀器分析條件見(jiàn)1.3。

2.4 線性關(guān)系與檢出限

在優(yōu)化的測(cè)定條件下，配制系列不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定，以各組分定量離子的峰面積對(duì)濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性關(guān)系和相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表2。

表2 顯性和隱性孔雀石綠樣品的檢出限和線性關(guān)系

由表2可見(jiàn)，在0.5～50 μg/L濃度范圍內(nèi)，MG、LMG質(zhì)量濃度和定量離子峰面積呈良好的線性關(guān)系。MG和LMG的儀器檢出限均為0.5 μg/L。

2.5 回收率與精密度

采用在空白樣品中添加標(biāo)準(zhǔn)溶液的方法，分別對(duì)2種不同水樣中孔雀石綠(MG和LMG)進(jìn)行 3個(gè)水平的添加回收試驗(yàn)，每個(gè)水平進(jìn)行 6次重復(fù)試驗(yàn)，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.9%～9.6%，回收率為71.5%～88.0%，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 精密度和回收試驗(yàn)結(jié)果 (n=6)

3 結(jié)語(yǔ)

建立了液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定養(yǎng)殖水樣中顯性孔雀石綠和隱性孔雀石綠殘留量的方法。該法具有快速、靈敏、準(zhǔn)確和操作簡(jiǎn)單的特點(diǎn)，各項(xiàng)技術(shù)指標(biāo)均滿足國(guó)內(nèi)外對(duì)孔雀石綠殘留檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)的要求。

[1] 張彤晴，楊洪生，林海，等.高效液相色譜法測(cè)定養(yǎng)殖水體中孔雀石綠和無(wú)色孔雀石綠[J].水產(chǎn)學(xué)報(bào), 2007,5(31):609-703.

[2] Kamila Mitrowska, Andrzej Posyniak, Jan Zmudzki. Determination of malachite green and leucmalachite green residues in water using liquid chromatography with visible and fluorescence detection and confirmation by tandem mass spcetrometry[J]. Journal of Chromatography A,2008,1 207(1):94-100.

[3] safark I, Safarikova M. Detection of low concentrations of malachite green and crystal violet in water[J]. Water research, 2008,36:196-200.