陳君義 孫慧宇 舒永蘭 王云飛

(1.張家港出入境檢驗檢疫局,張家港 215600； 2.徐州出入境檢驗檢疫局,徐州 221006)

氯霉素(chloramphenicol，CAP)屬廣譜抗生素，曾作為動物臨床常用的抗生素用于預防和治療動物因細菌、立克氏體引起的炎癥和疾病。但由于氯霉素具有抑制造血機能等毒副作用，還可引起不同的個體反應，如肝損傷、視神經炎、白血病等，因此目前許多國家嚴格禁止將氯霉素用于食用動物，規(guī)定其最高殘留限量為0～0. 01 mg/kg。隨著科學技術的進步，國外對進口動物源性產品中氯霉素的檢出限量不斷降低，歐盟的最低執(zhí)行限量值為0.3 μg/kg[1]。有的國家甚至禁止對中國的某些動物源產品的進口，這對我國的出口貿易造成了嚴重影響，因此動物源性產品中氯霉素的殘留檢測變得尤為重要。

目前有關氯霉素在食品中的殘留量分析方法主要有酶聯(lián)免疫(ELISA)法[2]、氣相色譜(GC)法[3]、氣相色譜質譜聯(lián)用(GC/MS)法[4]、液相色譜(HPLC)法[5]和液相色譜-串聯(lián)質譜(LC-MS/MS)法[6-10]等。ELISA 法主要用于快速篩選檢測，但定性和定量均不夠準確；GC和GC/MS存在檢出限難以達到要求、背景干擾較大或樣品凈化不完全以及衍生化難等問題；HPLC分析較準確且過程相對較簡便，因而應用較多，但隨著LC-MS/MS技術發(fā)展的日趨成熟，該方法被越來越多地應用于測定和確證動物源產品中氯霉素的痕量殘留。以待測物的同位素標記物作為內標，補償前處理過程和定量過程中的偏差，可以解決LC分析過程中的基質效應和處理過程中提取效率的問題[11]。

筆者在動物源性樣品中加入氘代氯霉素作為內標，經乙酸乙酯提取、正己烷去脂后，無需過凈化小柱，直接用LC-MS/MS測定動物源性產品中氯霉素殘留量。該法操作簡便，分析時間短，定性和定量的準確性高，滿足進出口食品的獸藥殘留監(jiān)控要求。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

液相色譜串聯(lián)質譜儀(LC-MS/MS)：API4000型，美國AB公司；

甲醇：HPLC級；

乙酸乙酯、正己烷：優(yōu)級純，國藥集團；

氯霉素標準品(CAP)：純度為98.5%，德國Dr. E公司；

氯霉素-d5標準品(CAP-d5)：純度為98.6%，德國Witega公司；用色譜級甲醇配制成1 000 μg/L的標準儲備液，貯存在4℃冰箱中，實驗中根據需要用甲醇稀釋至適當濃度的標準工作液。

實驗用水為去離子水。

1.2 樣品制備

在龍蝦樣品中取出有代表性的樣品約500 g，取可食部分用粉碎機絞碎；從所取腸衣樣品中取出有代表性樣品約300 g，用剪刀剪碎(小于0.5 cm)。將粉碎的樣品混合均勻，均分成兩份，分別裝入潔凈容器作為待測樣，密封,在-18℃條件下保存。

1.3 樣品前處理

(1)龍蝦：稱取5 g樣品(精確到0.01 g)置于50 mL具塞離心管中，準確加入200 μL氯霉素-d5內標溶液(10 ng/mL)，加入20 mL乙酸乙酯，高速均質2 min，超聲10 min，然后以3 500 r/min離心5 min，收集上清液，于45℃下旋轉蒸發(fā)至近干，然后依次加入4 mL正己烷和5.0 mL水溶解，并轉移至10 mL試管中。振蕩1 min后離心，棄去有機相，取1 mL水相經0.45 μm濾膜過濾后上機測定。

(2)腸衣：稱取5 g樣品(精確到0.01 g)置于50 mL具塞離心管中，準確加入200 μL氯霉素-d5內標溶液(10 ng/mL)，加入20 mL乙酸乙酯，于渦旋混合器上混勻1 min，超聲波超聲20 min，然后以3 500 r/min離心5 min，收集上清液，并按上述方法操作。

1.4 液相色譜與質譜條件

色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；柱溫：25℃；流速：0.5 mL/min；進樣量：25 μL；流動相：A相為甲醇，B相為水。

梯度洗脫程序：0～2 min，A相保持30%；2.0～3.5 min，A相從30%線性升至90%，保持3.5 min；0.1 min內，A相降至30%，保持至4 min。

電噴霧離子源，負離子掃描模式(ESI-)，多反應監(jiān)測(MRM)；離子源噴霧電壓：-4 500 V；離子源溫度：550℃。

2 結果與討論

2.1 樣品前處理

目前在檢測食品中氯霉素殘留時通常采用乙酸乙酯提取，用正己烷去脂，然后再用乙酸乙酯反萃取等前處理方法。由于樣品很難在均質器中達到完全破碎，尤其是腸衣，故在試驗中，通過超聲的方法改善提取效果，加入同位素內標，補償提取偏差，免去小柱凈化步驟，縮短了前處理時間，減少了有機試劑消耗量且有效保證了分析結果的穩(wěn)定性和準確性。

2.2 質譜條件的優(yōu)化

氯霉素分子式為C11H12O5N2Cl2，分子量為322，其同位素內標(5個不同位置上的氫被氘取代)的分子量為327，兩者的理化性質接近，使用同位素可以矯正在樣品提取過程中氯霉素的損失，提高測定方法的回收率。

將氯霉素標準品在負離子模式下進行質譜全掃描，其母離子為m/z320.8，主要子離子碎片有m/z151.8、 175.8、193.7、256.8(見圖1)。根據豐度大小選擇定性和定量離子對，見表1。

圖1 氯霉素全掃描圖

2.3 標準工作曲線

在標準系列溶液中加入40 μL(與樣品中同位素內標體積比例相同)的同位素混合內標，按上述實驗步驟操作，以峰面積比X(標準峰面積與內標峰面積之比)為橫坐標，氯霉素濃度c(ng/mL)為縱坐標，繪制標準曲線，線性回歸方程為c= 0.245 7X-0.001 3，r2=0.999 4，標準工作曲線線性范圍為0.05～2.0 ng/mL。

2.4 樣品中氯霉素含量的計算

樣品處理后經液相色譜-串聯(lián)質譜檢測后，按照公式(1)計算樣品中氯霉素的含量：

(1)

其中：X——樣品中氯霉素的含量，μg/kg；

c——最終提取物中濃度，ng/mL；

V——最終定容體積，mL；

M——稱樣量，g。

按此方法檢測，樣品中氯霉素的檢出限為0.05 μg/kg。

2.5 加標回收率和精密度試驗

以不含有氯霉素殘留的龍蝦和豬腸衣為樣品，按照1.3方法進行提取、凈化和測定，在0.1、0.2、0.3 μg/kg 3個濃度水平上進行加標回收試驗，氯霉素在兩種樣品中的添加回收率范圍為71.8%～90.0%，相對標準偏差均小于3%，試驗結果見表2。

表2 龍蝦和腸衣樣品中不同添加水平的回收率(n=5)

2.6 方法適用性

使用該方法對動物源性食品龍蝦、銀魚、蜆肉、羊腸衣、豬腸衣、蝦仁等進行檢測，檢測回收率穩(wěn)定。

3 結論

采用氯霉素的同位素標記作為內標，補償了處理過程和液質聯(lián)用中產生的誤差，有效地提高了定量的靈敏度，保證了實驗的回收率；同時采用同位素內標，以雙離子監(jiān)控的模式，可以準確地甄別樣品中氯霉素的存在，保證了檢測結果的準確性，滿足國內外對該類化合物在進出口食品中的監(jiān)控要求。提取過程無需使用凈化小柱，檢測成本低，操作簡便，分析時間短，實現了動物源性食品中對氯霉素的快速、經濟檢測。

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