陳永芳 劉思全 王立國(guó) 賈瑞寶

(1.濟(jì)南大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，濟(jì)南 250022； 2.濟(jì)南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，濟(jì)南 250022； 3.濟(jì)南市供排水監(jiān)測(cè)中心，濟(jì)南 250021)

近年來(lái)，隨著我國(guó)水體的富營(yíng)養(yǎng)化程度逐漸加劇，藍(lán)藻水華和赤潮的發(fā)生逐漸增加。80%的藍(lán)藻水華都可以檢測(cè)出次生代謝產(chǎn)物——微囊藻毒素(microcystins，MCs)，它對(duì)水體環(huán)境和人群健康的危害已成為全球關(guān)注的重大環(huán)境問(wèn)題之一[1]。

微囊藻毒素為七肽單環(huán)肝毒素[2]，結(jié)構(gòu)中存在著環(huán)狀結(jié)構(gòu)和間隔雙鍵，因而具有相當(dāng)?shù)姆€(wěn)定性。它能夠強(qiáng)烈抑制蛋白磷酸酶的活性[3]，當(dāng)細(xì)胞破裂或衰老時(shí)毒素釋放進(jìn)入水中[4,5]，同時(shí)它還是強(qiáng)烈的肝臟腫瘤促進(jìn)劑[6]。因此微囊藻毒素異構(gòu)體的分離與表征對(duì)于分析藍(lán)藻水華對(duì)水體污染的影響具有重要的作用。

筆者以甲醇-水為提取溶劑對(duì)藍(lán)藻進(jìn)行粗提，利用固相萃取手段對(duì)微囊藻毒素粗品進(jìn)行初步純化與除雜后用高效液相色譜成功分離了微囊藻毒素異構(gòu)體。使用HPLC-MS對(duì)微囊藻毒素的主要3種異構(gòu)體進(jìn)行了表征。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：Agilent 1100型，美國(guó)安捷倫科技有限公司；

HPLC-MS聯(lián)用儀：美國(guó)熱電公司；

離心機(jī)：TGL-16C型，上海安亭科學(xué)儀器廠；

C18固相萃取小柱：容量6 mL，填充500 mg，天津博納艾杰爾科技有限公司；

甲醇：色譜純，山東禹王實(shí)業(yè)有限公司化工分公司，使用時(shí)與水配制成不同的比例；

乙腈：分析純，上海化學(xué)試劑研究所，使用時(shí)與水配制成不同的比例；

三氟乙酸：化學(xué)純，上?；瘜W(xué)試劑公司；

微囊藻毒素標(biāo)準(zhǔn)品-LR：美國(guó)sigma 公司；

微囊藻毒素標(biāo)準(zhǔn)品-RR：美國(guó)sigma 公司；

亞沸蒸餾水：用SYZ-550型石英亞沸高純水蒸餾器制備。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

(1)粗提：首先將從云南滇池得到的藍(lán)藻離心，然后按一定的比例加入20%～65%的甲醇水溶液，室溫下磁力攪拌，超聲震蕩，以10 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心，取出上清液；殘?jiān)貜?fù)萃取兩次，合并上清液；將提取液過(guò)0.45 μm的微濾膜，除去大分子雜質(zhì)，得微囊藻毒素粗品。

(2)純化與富集：將粗品通過(guò)ODS C18反相萃取柱，依次用10 mL 100%甲醇、10mL超純水活化萃取柱，再將粗提液以1 mL/min的流速流經(jīng)固相萃取柱進(jìn)行富集濃縮，而后用一定濃度的甲醇淋洗。收集洗脫液，于30℃條件下濃縮至1 mL。

(3)分離：采用高效液相色譜法。色譜條件：Kromasil C18色譜柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm，12 nm)；流動(dòng)相：甲醇-水溶液、乙腈-水溶液(三氟乙酸緩沖溶液)；柱溫：室溫；檢測(cè)波長(zhǎng)238 nm；流速：0.5 mL/min；進(jìn)樣量：2～10 μL；保留時(shí)間定性。

(4)表征：高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(HPLC-MS)。質(zhì)譜條件：噴霧電壓：4.5 kV；聚焦電壓：220 kV；入口電壓：12 V；離子源溫度：215℃；錐孔電壓：30 V；掃描范圍：m/z75～1 300。

2 結(jié)果與討論

2.1 萃取與預(yù)純化

(1)萃?。何墨I(xiàn)[7]報(bào)道了在藍(lán)藻中提取微囊藻毒素的方法，主要是用50%～90%的甲醇溶液進(jìn)行萃取，通過(guò)實(shí)驗(yàn)探討，發(fā)現(xiàn)65%的甲醇溶液提取效果最好，可最大程度提取出藍(lán)藻細(xì)胞內(nèi)外的微囊藻毒素。

(2)預(yù)純化：將微囊藻毒素粗品通過(guò)0.45 μm的微濾膜，除去大分子物質(zhì)以及纖維等雜質(zhì)，然后采用反相C18固相萃取柱進(jìn)一步除雜與初步純化。通過(guò)探討發(fā)現(xiàn)，甲醇濃度越大，除雜效果越好，但當(dāng)增大到一定濃度時(shí)，微囊藻毒素也會(huì)相應(yīng)越多的洗脫出來(lái)，因此采用40%甲醇淋洗，70%甲醇洗脫可達(dá)到較好的效果。

2.2 高效液相色譜分離

文獻(xiàn)[8-11]報(bào)道對(duì)微囊藻毒素異構(gòu)體的分離主要采取反相高效液相色譜法，不同流動(dòng)相對(duì)藻毒素的分離效果影響較大。筆者主要探討了不同比例的甲醇-水體系、乙腈-水體系和乙腈-水-0.01%三氟乙酸體系對(duì)微囊藻毒素異構(gòu)體的分離效果。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：不同比例的甲醇-水體系對(duì)分離結(jié)果的影響，發(fā)現(xiàn)80%的甲醇-水作為流動(dòng)相時(shí)，分離結(jié)果較好，但微囊藻毒素的各異構(gòu)體仍然不能完全分開(kāi)，這與文獻(xiàn)報(bào)道有明顯的區(qū)別；乙腈-水體系表現(xiàn)出與甲醇-水類(lèi)似的規(guī)律，提高流動(dòng)相中有機(jī)溶劑比例，微囊藻毒素出峰較早，尤其對(duì)于早出峰的MC-YR分析干擾較大，而體積分?jǐn)?shù)降低時(shí)，MC-LR出峰則較遲且峰形較差，通過(guò)對(duì)比發(fā)現(xiàn)采用80%的乙腈作為流動(dòng)相，分離效果較好；而在乙腈-水體系中加入0.01%三氟乙酸時(shí)，并沒(méi)出現(xiàn)如文獻(xiàn)報(bào)道的更好分離效果。

將滇池藍(lán)藻提取物色譜圖與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在同樣色譜條件下得到的色譜圖對(duì)照，比較各異構(gòu)體的保留時(shí)間，初步判定滇池藍(lán)藻中含有微囊藻毒素的3種主要異構(gòu)體，即MC-YR 3.335 min, MC-RR 4.679 min和MC-LR 7.37 min。

2.3 高效液相色譜-質(zhì)譜表征

對(duì)所得的微囊藻毒素異構(gòu)體進(jìn)行HPLC-MS表征，其總離子流圖及保留時(shí)間為4.85 min的組分質(zhì)譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 微囊藻毒素異構(gòu)體HPLC-MS圖

由圖1可以看出，保留時(shí)間為4.85 min的組分一級(jí)質(zhì)譜圖m/z996.17為[M+H]+母離子峰，而MC-LR的分子量為995.17，其它碎片峰也與文獻(xiàn)報(bào)道的MC-LR碎片峰相符。

同樣，在總離子流圖中保留時(shí)間為4.54 min和5.28 min對(duì)應(yīng)的離子峰分別為m/z1 039.2和1 046.18為[M+H]+母離子峰，判斷出為微囊藻毒素異構(gòu)體MC-YR和MC-RR。

3 結(jié)論

考查了微囊藻毒素異構(gòu)體提取與純化的條件，以及高相液相色譜中流動(dòng)相種類(lèi)和比例對(duì)藻毒素異構(gòu)體分離結(jié)果的影響，結(jié)果表明：65%甲醇溶液提取效果較好，采用80%乙腈-水體系作為流動(dòng)相得到了較好的分離效果。采用HPLC-MS對(duì)微囊藻毒素主要3種異構(gòu)體進(jìn)行表征。目前,HPLC方法雖然是制備微囊藻毒素純品的最實(shí)用方法，但仍存在制備量較小、制備成本較高的問(wèn)題。隨著微囊藻毒素需求量的增加，對(duì)微囊藻毒素的提取與純化方法需進(jìn)行進(jìn)一步的研究，以尋求更高效的制備、純化技術(shù)來(lái)提取更大量的微囊藻毒素純品。

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