(1.吉林師范大學(xué)化學(xué)學(xué)院,四平 136000; 2.長春師范學(xué)院,長春 130032)
紅景天為景天科(Crassulaceae)植物大花紅景天屬(Rhodiola S achalinensis L.)的干燥根及根莖,它是在青藏高原海拔3 400~5 700 m純凈無污染環(huán)境下生長的一種珍貴藥用植物。紅景天的藥理學(xué)研究及臨床實踐表明,其具有較好的抗疲勞和抗缺氧[1,2]、抗微波輻射[3]、抗腫瘤[4]、解毒、提高人體免疫力[5]、增強記憶力、強心活血[6,7]、平衡血糖等作用,是人體細胞的潛能激活劑,對人體神經(jīng)系統(tǒng)、血液循環(huán)系統(tǒng)、代謝系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)等具有極好的整體調(diào)理作用。紅景天的有效成分為紅景天苷(Salidroside,結(jié)構(gòu)式如圖1),紅景天苷常被用來評價紅景天屬植物的藥用價值,是迄今為止研究最多的有效成分之一[8]。已有許多文獻報道利用HPLC法測定紅景天中紅景天苷的含量[9-13],但是利用熒光光譜法測定紅景天中紅景天苷的含量尚未見報道。筆者建立了測定紅景天苷的熒光光譜方法,并優(yōu)化了實驗條件,取得了滿意的實驗結(jié)果。
圖1 紅景天苷的分子結(jié)構(gòu)式
熒光光譜儀:RF-5301PC型,日本島津公司;
分光光度計:Shimadzu UV-1700型,日本島津公司;
數(shù)字酸度計:pHS-3C型,杭州東興設(shè)備儀器廠;
紅景天苷標(biāo)準品:編號110818-200404,中國藥品生物制品檢定所;
實驗所用試劑均為分析純;
實驗用水均為二次蒸餾水。
紅景天苷溶液:稱取適量的紅景天苷標(biāo)準品,用水溶解后定容于10 mL容量瓶中,濃度為5×10-4mol/L。
不同pH值的Britton-Robinson緩沖液:將1.33 mL磷酸、1.18 mL冰乙酸和1.24 g硼酸(用適量水溶解)混合后定容于500 mL容量瓶中,該酸混合液(A液)中酸的濃度約為0.04 mol/L;稱取4.0 g NaOH,用水溶解后定容于500 mL的容量瓶中,則該堿液(B液)中堿的濃度約為0.20 mol/L;將A液和B液按一定比例混合,并用酸度計調(diào)節(jié)其pH值分別為2.32、2.61、3.39、4.63、5.39、6.52、7.31、8.60、9.43、10.69、11.61和12.71。
于4 mL比色管中加入50 μL 2.5×10-4mol/L紅景天苷溶液,然后用緩沖溶液(pH 7.31)配制成2.5 mL溶液,藥物的濃度為5 μmol/L,平行配制5份,考查時間、酸度、激發(fā)光和溫度對體系熒光強度的影響。
配制紅景天苷標(biāo)準溶液系列:0.1、0.2、0.4、0.8、1.0、2.0、10、20、40、60、80、100 μg/mL,在310 nm處測定紅景天苷熒光強度,以熒光強度F為縱坐標(biāo),以紅景天苷濃度c為橫坐標(biāo)進行線性回歸。
在濃度為2 μmol/L的紅景天苷溶液中加入4種常見金屬離子Cu2+、Mg2+、Al3+和Fe3+,考查共存離子對熒光強度的影響。
激發(fā)和發(fā)射狹縫均為5 nm,以被測物的最大紫外吸收波長作為激發(fā)波長測量熒光發(fā)射光譜,確定最佳發(fā)射波長;在選定的最佳發(fā)射波長下,改變激發(fā)波長,測量熒光激發(fā)光譜,確定最佳激發(fā)波長。
濃度為5 μmol/L的紅景天苷溶液的熒光光譜如圖2所示。激發(fā)波長為275 nm,發(fā)射光譜在280~500 nm范圍內(nèi),發(fā)射峰波長在310 nm處。
圖2 紅景天苷的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜
將新配制的濃度為5 μmol/L的紅景天苷溶液在48 h內(nèi)進行連續(xù)測量,間隔一定時間記錄熒光強度,結(jié)果列于表1。從表1中看出紅景天苷的熒光強度穩(wěn)定,在48 h內(nèi)變化很小。
表1 放置時間對紅景天苷熒光強度的影響
溫度對于溶液的熒光強度有著一定的影響,在溶液溫度下降的過程中,介質(zhì)的黏度逐漸增大,熒光物質(zhì)分子與溶劑分子的碰撞也隨之減少,這會給熒光效率造成一定的影響;而溶液溫度上升過程中,一方面分子內(nèi)部能量發(fā)生轉(zhuǎn)換作用,另一方面激發(fā)分子可能與溶劑分子發(fā)生某些可逆的光化學(xué)反應(yīng),從而導(dǎo)致熒光強度降低。
考察濃度為10 μmol/L紅景天苷溶液在20~60℃范圍內(nèi)熒光強度的變化,結(jié)果如表2所示。由表2可以看出,隨溫度的升高熒光強度降低,紅景天苷在溫度為60℃時的熒光強度幾乎是常溫條件下的一半。在20℃時,熒光值較大且比較穩(wěn)定,是測定的合適溫度,因此本實驗選在常溫條件下測定。
表2 溫度對紅景天苷熒光強度的影響
室溫條件下,固定紅景天苷濃度為5 μmol/L,在不同酸度范圍內(nèi)測定熒光強度,結(jié)果見圖3。從圖3可以看出,隨pH值的增加熒光強度逐漸降低,在pH<7時,降低不明顯;當(dāng)pH>7時,熒光強度隨pH值的增加而明顯降低;當(dāng)pH>11時,熒光強度幾乎觀察不到。實驗最終確定在溶液酸度為pH 7的條件下進行測定。
圖3 溶液酸度對紅景天苷熒光強度的影響
考查了乙醇濃度對體系熒光強度的影響,見圖4。由圖4可知,隨乙醇含量增加紅景天苷熒光強度隨之增大,當(dāng)乙醇含量大于50%時,紅景天苷熒光強度幾乎不再隨乙醇含量的增加而增大。實驗結(jié)果表明,乙醇濃度對藥物熒光值影響較大。由于乙醇溶劑易揮發(fā),且乙醇對熒光增強的影響不是很大,因此實驗選擇在水溶液中進行測定。
圖4 乙醇對紅景天苷熒光強度的影響
紅景天苷濃度在0.04~18.03 μg/mL的范圍內(nèi),線性回歸方程為F=19.22c+3.365,r=0.999 6,回歸曲線見圖5。光學(xué)分析法的檢出限按DL=3s/k計算,其中s為空白溶液信號的標(biāo)準偏差,k為靈敏度(即標(biāo)準曲線的斜率)。經(jīng)計算紅景天苷的檢出限為0.019 μg/mL。
圖5 紅景天苷標(biāo)準曲線圖
精密吸取標(biāo)準溶液,連續(xù)取樣5次進行測定,其熒光強度為319.06、316.59、318.95、317.88、317.53,相對標(biāo)準偏差為0.33%(n=5),表明方法的精密度良好。
濃度為6.01 μg/mL紅景天苷標(biāo)準品溶液其理論熒光值為118.09,實際測得值為122.81,其相對誤差為4.0%,表明方法的準確度良好。
血漿中存在多種金屬離子,雖然濃度較低,但是卻起著非常重要的生理作用。在選定的實驗條件下,研究了4種常見金屬離子對紅景天苷測定結(jié)果的影響。研究了紅景天苷濃度為2 μmol/L、測定的相對誤差在±5%之內(nèi)時,共存離子的最大允許濃度,結(jié)果見表3。
表3 共存物的影響(n=5)
建立了測定紅景天苷的熒光光譜方法??疾炝巳軇O性、放置時間、溶液pH值和共存離子對紅景天苷熒光強度測定的影響。實驗結(jié)果表明,熒光光譜法具有儀器設(shè)備簡單、靈敏度高等優(yōu)點。該法的建立為紅景天苷含量測定提供了一種新的方法。
[1] 陳亞東,曹秀蘭.高山紅景天對小鼠耐缺氧、抗疲勞及耐低溫作用的影響[J].中國中醫(yī)藥科技,2002,9(3):157-158.
[2] 劉志偉,吳謀成,陳平.菱葉紅景天對小鼠學(xué)習(xí)記憶影響及耐缺氧實驗[J].營養(yǎng)學(xué)報,2003,25(1):101-104.
[3] 駱傳環(huán),高月,王作華,等.紅景天多糖的抗放實驗的研究[J].中華放射醫(yī)學(xué)與防護雜志,1999,14(5):340-341.
[4] 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院,中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)信息研究所.醫(yī)學(xué)主題詞表[M].北京:中國計量出版社,2002.
[5] 趙文,蔣東升,邊慶榮,等.薔薇紅景天提取液對小鼠免疫功能的影響[J].衛(wèi)生毒理學(xué)雜志,2000,14(3):159.
[6] 余國祥,蔡鷹.紅景天生脈口服液抗實驗性心律失常的作用[J].云南中醫(yī)中藥雜志,2003,24(4):37-38.
[7] 毛靜遠,王化良,趙如菊,等.紅景天膠囊治療冠心病心絞痛臨床研究[J].中國醫(yī)藥學(xué)報,2002,17(8):480-483.
[8] 李君,陳志,李建民,等.紅景天的研究進展[J].云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2007,22:61-64.
[9] 張早華,儲戟農(nóng),林文翰,等.高效液相色譜法測定紅景天注射液中紅景天苷的含量[J].中國中醫(yī)藥信息雜志,2005,12(11):51-52.
[10] 楊曉艷,蘆啟琴,張曉峰.HPLC法測定紅景天根皮中紅景天苷的含量[J].分析試驗室,2008,27:305-306.
[11] 安偉建,陳冠,王文彤,等.HPLC法測定不同產(chǎn)地紅景天屬植物中紅景天苷[J].中草藥,2007,38(7):1 096-1 097.
[12] 孟健,王淑芬,韓飛,等.SPE-HPLC測定注射用紅景天(凍干)中紅景天苷和酪醇的含量[J].中國中藥雜志,2006,31(2):119-121.
[13] 陳志英,陳玉婷,王丹紅.HPLC測定不同品種紅景天中紅景天苷的含量[J].中國中藥雜志,2006,31(11):939-941.