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        GC-MS法測(cè)定發(fā)酵食品中氨基甲酸乙酯含量的測(cè)量不確定度評(píng)定*

        2011-01-22 01:30:48譚波濤郝媛媛
        化學(xué)分析計(jì)量 2011年5期
        關(guān)鍵詞:峰高丁酯甲酸

        譚波濤 郝媛媛

        (安徽省阜陽(yáng)市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所,阜陽(yáng) 236000)

        氨基甲酸乙酯又名聚氨酯(ethyl carbamate,簡(jiǎn)稱(chēng)EC)存在于發(fā)酵食品中,是一種多位點(diǎn)致癌物[1]。針對(duì)發(fā)酵食品中EC的測(cè)定,目前主要以儀器分析為主,如高效液相色譜-熒光檢測(cè)器法(HPLC-FLD)[2]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)[3-5]等。筆者以氨基甲酸丁酯作為內(nèi)標(biāo)物,采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用、選擇離子檢測(cè)模式用于發(fā)酵食品中EC的測(cè)定,并對(duì)EC測(cè)量結(jié)果的不確定度進(jìn)行了評(píng)估。

        1 實(shí)驗(yàn)部分

        1.1 主要儀器與試劑

        氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀:5975C型,配多功能自動(dòng)進(jìn)樣器,美國(guó)Agilent公司;

        固相萃取裝置:天津市恒奧科技發(fā)展有限公司;

        旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀:RE-2000型,上海申勝生物技術(shù)有限公司;

        超聲波儀:SK1200H型,上??茖?dǎo)超聲儀器有限公司;

        去離子水發(fā)生器:AXLB1020-1型,重慶阿修羅科技發(fā)展有限公司;

        甲醇、二氯甲烷、乙酸乙酯:色譜純;

        無(wú)水硫酸鈉:經(jīng)650℃灼燒4 h,置于干燥器內(nèi)備用;

        標(biāo)準(zhǔn)品EC、氨基甲酸丁酯:純度均為99.0%,上海安譜科技有限公司;

        實(shí)驗(yàn)室用水均為超純水。

        1.2 色譜條件

        色譜柱:Rtx?-Wax(30 m×0.25 mm,0.5 μm,美國(guó)瑞斯泰克公司)或相當(dāng)者;進(jìn)樣口溫度:220℃;柱溫程序:初溫40℃,保持1.0 min,以10℃/min升至60℃,再以5℃/min升至160℃,保持1.0 min,最后在220℃下運(yùn)行10 min;載氣:高純氦氣(99.999%),流速:1.0 mL/min;不分流進(jìn)樣;進(jìn)樣體積:1 μL。

        1.3 質(zhì)譜條件

        離子源(EI)溫度:230℃;電子轟擊能量:70 eV;接口溫度:220℃;電子倍增器電壓:1 157 V;選擇離子監(jiān)測(cè)方式(SIM);EC定量離子:m/z62;特征離子:m/z62、74、89;內(nèi)標(biāo)物氨基甲酸丁酯定量離子:m/z62;特征離子:m/z62、74、56;溶劑延遲時(shí)間:19.0 min。

        1.4 樣品前處理

        準(zhǔn)確稱(chēng)取5.0 g固體樣品或準(zhǔn)確吸取5.0 mL液體樣品于25 mL比色管中,加入氨基甲酸丁酯內(nèi)標(biāo),飽和氯化鈉溶液溶解并定容至刻度,振蕩提取30.0 min,過(guò)濾。準(zhǔn)確移取上述待測(cè)樣液5.0 mL加到5.0 g的硅藻土液液萃取小柱上,靜置吸附5 min,用30 mL二氯甲烷均分6次洗脫硅藻土萃取柱,將洗脫液用無(wú)水硫酸鈉過(guò)濾后于30℃下旋干,用乙酸乙酯定容至5.0 mL,混勻,待測(cè)。

        1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

        準(zhǔn)確稱(chēng)取氨基甲酸丁酯0.104 2 g于100 mL棕色容量瓶中,用乙酸乙酯溶解并定容至刻度,配制成濃度為1.042 mg/mL的氨基甲酸丁酯標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。準(zhǔn)確稱(chēng)取EC 0.105 7 g于100 mL棕色容量瓶中,乙酸乙酯溶解并定容至刻度,配制成濃度為1.057 mg/mL的EC標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。準(zhǔn)確吸取EC、氨基甲酸丁酯的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,乙酸乙酯溶解逐級(jí)稀釋?zhuān)渲瞥蒃C與內(nèi)標(biāo)物濃度的比值分別為0.05、0.1、0.2、0.5、1.0且內(nèi)標(biāo)物濃度為400 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)校正溶液系列濃度供GC-MS測(cè)定。

        1.6 定性定量

        吸取1 μL試樣液或標(biāo)準(zhǔn)液注入氣質(zhì)聯(lián)用儀中,以EC與內(nèi)標(biāo)物濃度的比值為橫坐標(biāo),EC與內(nèi)標(biāo)物的峰高比值為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。以試樣峰與內(nèi)標(biāo)峰的相對(duì)保留時(shí)間定性,以試樣峰與內(nèi)標(biāo)峰的定量離子峰高比多點(diǎn)校正后定量。

        2 數(shù)學(xué)模型

        樣品中EC含量測(cè)量結(jié)果可以表示為:

        式中:X——試樣中EC含量,ng/g;

        Asn——實(shí)際樣品中EC的峰高;

        As1——實(shí)際測(cè)定時(shí),內(nèi)標(biāo)物氨基甲酸丁酯的峰高;

        ms1——實(shí)際測(cè)定時(shí),內(nèi)標(biāo)物氨基甲酸丁酯的質(zhì)量,ng;

        m——樣品質(zhì)量,g;

        fv——實(shí)際測(cè)定時(shí)樣品和內(nèi)標(biāo)物稀釋倍數(shù);

        R——EC及其內(nèi)標(biāo)物氨基甲酸丁酯的相對(duì)校正因子,

        An——EC標(biāo)樣的峰高;

        c1——內(nèi)標(biāo)物氨基甲酸丁酯的濃度,ng/mL;

        A1——內(nèi)標(biāo)物氨基甲酸丁酯的峰高;

        cn——EC的濃度,ng/mL。

        3 測(cè)定結(jié)果

        5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液分別測(cè)量3次,結(jié)果見(jiàn)表1、表2。

        表1 EC-氨基甲酸丁酯標(biāo)準(zhǔn)校正液峰高系列測(cè)定結(jié)果

        表2 EC-氨基甲酸丁酯標(biāo)準(zhǔn)校正液中標(biāo)準(zhǔn)品峰高(Ani)與內(nèi)標(biāo)峰高(A1i)之比的測(cè)定結(jié)果

        根據(jù)表1和表2數(shù)據(jù)作標(biāo)準(zhǔn)工作曲線,線性方程為y=1.310 225x-0.002 434,其中曲線相關(guān)系數(shù)r=0.999 9,b=1.310 225,a=-0.002 434。當(dāng)內(nèi)標(biāo)濃度為400 ng/mL時(shí),重復(fù)性條件下測(cè)定樣品6次,對(duì)應(yīng)的樣品濃度比和樣品測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。

        表3 樣品測(cè)定結(jié)果

        4 發(fā)酵食品中EC測(cè)量結(jié)果的不確定度評(píng)定

        從實(shí)驗(yàn)方法和數(shù)學(xué)模型可以看出,檢驗(yàn)由標(biāo)準(zhǔn)液制備、樣品制備、儀器測(cè)定等幾部分組成。因此測(cè)量不確定度的主要來(lái)源有(1)EC及其內(nèi)標(biāo)物氨基甲酸丁酯相對(duì)校正引入的不確定度;(2)內(nèi)標(biāo)物純度及樣品和內(nèi)標(biāo)物稱(chēng)量引入的不確定度;(3)定容配制測(cè)量液、進(jìn)樣引入的測(cè)量不確定度;(4)實(shí)際測(cè)量過(guò)程中,樣品中EC的峰高和內(nèi)標(biāo)物氨基甲酸丁酯的峰高比(Asn/Asl)引入的不確定度;(5)重復(fù)性測(cè)量引入的不確定度。

        4.1 EC及其內(nèi)標(biāo)物氨基甲酸丁酯校正引入的不確定度

        (1)擬合標(biāo)準(zhǔn)工作曲線求值引入的不確定度

        以EC與內(nèi)標(biāo)物濃度的比值X為橫坐標(biāo),EC與內(nèi)標(biāo)物的峰高比值Y為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線,曲線的斜率即為相對(duì)校正因子R。根據(jù)表1和表2數(shù)據(jù),標(biāo)準(zhǔn)工作曲線中殘余標(biāo)準(zhǔn)差S和標(biāo)準(zhǔn)工作曲線中自變量偏差平方和Sxx分別為:

        測(cè)量樣品溶液6次,即P=6,根據(jù)表3數(shù)據(jù),樣品溶液由于擬合標(biāo)準(zhǔn)工作曲線求值引入的不確定度為:

        其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度:

        (2)EC-氨基甲酸丁酯標(biāo)準(zhǔn)校正液濃度比引入的測(cè)量不確定度

        配制EC-氨基甲酸丁酯標(biāo)準(zhǔn)校正液時(shí),EC標(biāo)準(zhǔn)品和內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品稱(chēng)量、定容等過(guò)程將引入不確定度。但是使用線性最小二乘法擬合曲線、求取相對(duì)校正因子的前提是假定橫坐標(biāo)量的不確定度遠(yuǎn)小于縱坐標(biāo)量的不確定度[6,7]。通常的An/Al不確定度計(jì)算程序僅僅與EC和內(nèi)標(biāo)物的峰高比值有關(guān),而與EC-氨基甲酸丁酯標(biāo)準(zhǔn)校正液不確定度無(wú)關(guān),也不與從同一溶液中逐次稀釋產(chǎn)生必然的相關(guān)性,因此EC-氨基甲酸丁酯標(biāo)準(zhǔn)校正液濃度比引入的測(cè)量不確定度可以忽略不計(jì)。

        4.2 內(nèi)標(biāo)物純度及樣品和內(nèi)標(biāo)物稱(chēng)量引入的不確定度

        (1)根據(jù)氨基甲酸丁酯的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書(shū),標(biāo)樣的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為1.0%,按照正態(tài)分布估算,取包含因子為3。則內(nèi)標(biāo)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度un1,rel約為0.0034。

        4.3 實(shí)際測(cè)量時(shí),內(nèi)標(biāo)物稱(chēng)量、定容配制測(cè)量液引入的測(cè)量不確定度

        (1) 使用容量瓶、移液管或移液槍所引入的體積不確定度主要有3個(gè)分量:①體積校準(zhǔn)引入的不確定度分量uV1,按JJG 196-2006《常用玻璃量器檢定規(guī)程》和JJG 646-2006《移液器檢定規(guī)程》規(guī)定的容量允差計(jì)算;②充滿液體至刻度的變動(dòng)性引入的不確定度分量uV2,通過(guò)A 類(lèi)不確定度評(píng)定得到,具體做法為連續(xù)核查10 次排出的體積的標(biāo)準(zhǔn)偏差(通過(guò)稱(chēng)量決定);③溶液溫度與檢定標(biāo)準(zhǔn)溫度(20℃) 不同引入的不確定度分量uV3,根據(jù)溶液體積膨脹系數(shù)計(jì)算。

        (3)在估算溫度變化對(duì)體積不確定度影響時(shí),認(rèn)為實(shí)驗(yàn)室的溫度一般在±4℃之間變動(dòng)。液體體積膨脹明顯大于容量瓶的體積膨脹,因此只需考慮前者。乙酸乙酯的體積膨脹率按照20℃時(shí)系數(shù)1.39×10-3/℃計(jì)算。根據(jù)實(shí)驗(yàn)情況,各體積不確定度見(jiàn)表4。

        表4 容量瓶、移液管或移液槍引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

        4.4 樣品測(cè)量中EC的峰高和內(nèi)標(biāo)物氨基甲酸丁酯的峰高比(Asn/Asl)引入的不確定度

        4.5 重復(fù)性測(cè)量引入的不確定度

        重復(fù)性測(cè)量引入的不確定度采用A類(lèi)評(píng)定。表3數(shù)據(jù)在格拉布斯檢驗(yàn)0.95置信水平下無(wú)粗大異常值。根據(jù)貝塞爾公式,計(jì)算6次測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)差的相對(duì)值為:

        5 相對(duì)合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度和相對(duì)擴(kuò)展不確定度

        根據(jù)以上評(píng)估過(guò)程,將不確定度的A類(lèi)評(píng)定結(jié)果和各分量評(píng)估結(jié)果合成,得出相對(duì)合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度:

        X=21.51 ng/mL,Urel=8.7%,k=2。

        6 結(jié)語(yǔ)

        通過(guò)對(duì)發(fā)酵食品中EC含量測(cè)量過(guò)程中影響測(cè)量結(jié)果不確定度的各因素進(jìn)行分析,結(jié)果表明,在測(cè)量結(jié)果的合成不確定度中,擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線求值引入的不確定度分量貢獻(xiàn)最大,其次是由樣品測(cè)量中EC的峰高和內(nèi)標(biāo)物氨基甲酸丁酯的峰高比(Asn/Asl)引入的不確定度分量。其原因是由于檢測(cè)器的計(jì)量特性、樣品分離條件和檢測(cè)重復(fù)性引入了較大的不確定度。由于測(cè)定采用了內(nèi)標(biāo)法,進(jìn)樣量變化和實(shí)驗(yàn)條件變化引入的誤差將因?yàn)闇y(cè)定的峰高比(Asn/Asl)而相互抵消。合理選擇樣品分離條件、提高儀器精度、提高操作人員技能、保證人員規(guī)范操作、合理選擇內(nèi)標(biāo)物的濃度、使其峰高與待測(cè)組分峰高不要相差太大,都可以有效減少不確定度,保證測(cè)量結(jié)果的準(zhǔn)確、可靠。

        [1] European Food Safety Authority. Ethyl carbamate and hydrocyanic acid in food and beverages Scientific Opinion of the Panel on Contaminants[J]. The EFSA Journal,2007,551:1-44.

        [2] Arminda Alves, Beatriz Oliveira, Paulo Herbert. Determination of ethyl carbamate in alcoholic beverages:an interlaboratory srudy to compare HPLC-FLD with GC-MSmethods[J]. Anal Bioanal Chem,2005,382:498-503.

        [3] AOAC Official Method 994.07 Ethyl Carbamate in Alcoholic Beverages and Soy Sauce Gas Chromatograpy/Mass Selective Detection Method [S].

        [4] 劉曉毅,劉艷琴,趙玉琪,等.醬油中的氨基甲酸乙酯檢測(cè)方法研究[J].中國(guó)調(diào)味品,2010,35(1):81-84.

        [5] 高年發(fā),寶菊花.氨基甲酸乙酯的研究進(jìn)展[J].中國(guó)釀造,2006,162(9):1-4.

        [6] JJF 1059-1999 測(cè)量不確定度評(píng)定與表示 [S].

        [7] CNAS-GL06 化學(xué)分析中不確定度的評(píng)估指南[S].

        [8] Eurachem/Citac Guide: Quantifying Uncertainty in Analytical Measurement[S].

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