張卓君 張 磊 姚 文 王艷艷 Ardythe Morrow 彭詠梅

母乳喂養(yǎng)是可減少兒童患病率和死亡率的一種健康促進(jìn)行為。而許多健康促進(jìn)的效應(yīng)都可歸因于母乳中發(fā)現(xiàn)的各種生物活性因子。一些局限于特定人群的研究已經(jīng)表明母乳中生物活性因子的差別可以影響兒童的健康和發(fā)育[1～4]。

寡糖是母乳中僅次于乳糖和脂肪的第三大固體組分，是近年來母乳生物活性因子研究的熱點(diǎn)之一。中性寡糖是保護(hù)嬰兒胃腸道的天然屏障，能降低早期嬰兒腹瀉和腸道感染[3,5～8]，可能降低泌尿道和呼吸道的感染[9，10]。近來有研究報(bào)道，母乳寡糖特別是2位連接的巖藻糖基寡糖有可能減少HIV感染的風(fēng)險(xiǎn)[11，12]。

母乳中性寡糖主要為巖藻糖基寡糖，巖藻糖基通過酶的作用連接到乳酰基或半乳糖上構(gòu)成其基本結(jié)構(gòu)，其連接可以有α1,2、α1,3和α1,4等形式。不同種族的母親母乳中性寡糖的種類和水平差異很大，認(rèn)為編碼酶的基因可能存在人群多態(tài)性并影響母乳中性寡糖的表達(dá)。在前期研究中發(fā)現(xiàn)FUT2的SNP位點(diǎn)rs601338的基因型是美國(guó)母親控制母乳ɑ1,2巖藻糖基寡糖水平的關(guān)鍵位點(diǎn)，但該位點(diǎn)的基因型并不影響中國(guó)母親母乳α1,2巖藻糖寡糖的表達(dá)。本次選取了FUT2的另一個(gè)SNP位點(diǎn)rs1047781進(jìn)行研究，以進(jìn)一步探究中國(guó)母親母乳中性寡糖水平與FUT2的SNP位點(diǎn)基因型之間的關(guān)系。

1 方法

1.1 納入標(biāo)準(zhǔn) ①健康足月兒的母親；②母親年齡18～49歲；③計(jì)劃在產(chǎn)后3個(gè)月內(nèi)至少75%以母乳喂養(yǎng)嬰兒。

1.2 排除標(biāo)準(zhǔn) ①雙胞胎或多胞胎的母親；②早產(chǎn)兒(胎齡<37周或出生體重<2 500 g)。

1.3 樣本收集 產(chǎn)后2周收集母乳和母親唾液樣本。收集母乳時(shí)吸空一側(cè)乳房所有乳汁，充分混勻后，分裝至2 mL凍存管，-80℃保存。用Oragene試劑盒收集母親唾液，4℃保存。

1.4 中性寡糖水平測(cè)定 共測(cè)定9種中性寡糖的水平，9種寡糖的相對(duì)分子質(zhì)量和連接形式如表1所示。

1.4.1 儀器與設(shè)備 制備液相色譜分析儀LC-8A (日本Shimadzu公司)，示差檢測(cè)器RID-10A(日本Shimadzu公司)，紫外檢測(cè)器SPD-20A(日本Shimadzu公司)，液相色譜分析儀LC-20AD(日本Shimadzu公司)，ODS-100Z色譜分析柱(4.6 mm×250 mm)(日本Tosoh公司)，冷凍干燥儀1-2LD (德國(guó)Christ公司)，真空濃縮儀RVC 2-2S(德國(guó)Christ公司)，Bio Gel P-2(Extra fine,<45 μm)(美國(guó)Bio Rad公司)，Milli-Q超純水系統(tǒng)(美國(guó)Millipore公司)。

表1 9種中性寡糖的相對(duì)分子質(zhì)量和連接形式

Tab 1 Molecular weight and connective type of 9 neutral oligosaccharides

OligosaccharideAbbreviationMolecualarWeightLocationoffucose2'-Fucosyllactose2'-FL488.44ɑ1,23-Fucosyllactose3-FL488.44ɑ1,3Lacto-N-fucopentaose-ⅠLNFP-Ⅰ853.70ɑ1,2Lacto-N-fucopentaose-ⅡLNFP-Ⅱ853.70ɑ1,4Lacto-N-fucopentaose-ⅢLNFP-Ⅲ853.70ɑ1,3Lacto-N-difucohexaose-ⅠLNDFH-Ⅰ999.91ɑ1,2Lacto-N-difucohexaose-ⅡLNDFH-Ⅱ999.91ɑ1,4Lacto-N-tetraoseLNT707.64NofucoseLacto-N-neotetraoseLNnT707.64Nofucose

1.4.2 試劑 PMP(美國(guó)Sigma公司)，乙腈(德國(guó)Fisher公司)，寡糖標(biāo)準(zhǔn)品(英國(guó)Dextra實(shí)驗(yàn)室)。

1.4.3 實(shí)驗(yàn)步驟 依據(jù)文獻(xiàn)[13,14] 建立的HPLC法測(cè)定母乳中性寡糖水平。方法如下：取母乳1 mL融化后用氯仿/甲醇萃取，用Bio Gel P-2(<45 μm)柱(2.6 cm×100 cm)層析，用示差檢測(cè)器記錄洗脫圖,峰值部分，分Pool1(3糖)和Pool2(4-6糖)混合并凍干(圖1)。再用PMP行柱前衍生[1,2]。衍生后最終樣品先凍干，再溶解為1 mL，實(shí)際上樣量為10 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)245 nm。色譜條件：Pool1：緩沖體系：KH2PO40.1 mol·L-1，用KOH調(diào)pH至7.0，流速1 mL·min-1；A相含16%乙腈，B相含30%乙腈；洗脫梯度：0～30 min B相0～50%。Pool2：緩沖體系：NH4AC 0.1 mol·L-1，用CH3COOH調(diào)pH至4.5，流速0.8 mL·min-1；A相含10%乙腈，B相含25%乙腈；洗脫梯度：0～40 min B相40%～100%。寡糖標(biāo)準(zhǔn)品按同樣步驟衍生，并根據(jù)濃度(1 、2、5、10和20 μg)與峰面積繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線的r2>0.99，計(jì)算實(shí)際樣品中的寡糖水平(圖2)。

1.5 Lewis表型的確定 Lewis表型與α1,2、α1,3和α1,4巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)關(guān)系見表2。

表2 Lewis表型與巖藻糖轉(zhuǎn)移酶表達(dá)關(guān)系

Tab 2 Relationship between Lewis phenotypes and the expression of fucosyltransferase

LewistypeLe(a-,b-)Le(a-,b+)Le(a+,b-)ɑ1,2linkedfucosyltransferase++-ɑ1,3linkedfucosyltransferase-++ɑ1,4linkedfucosyltransferase-++

母乳的Lewis表型可以分為3類[15]。Le(a-,b-)型：，因缺少ɑ1,3和ɑ1,4巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶，母乳中3-FL，LNFP-Ⅱ，LNFP-Ⅲ，LNDFH-Ⅱ的水平較低；因存在ɑ1,2巖藻糖轉(zhuǎn)移酶2′-FL,LNFP-Ⅰ和LNDFH-Ⅰ水平較高。Le(a-,b+)：母乳可檢測(cè)出所有的巖藻糖基寡糖；Le(a+,b-)：因不表達(dá)ɑ1,2巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶，而表達(dá)ɑ1,4和ɑ1,3巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶，母乳中2′-FL,LNFP-Ⅰ和LNDFH-Ⅰ的水平較低，3′-FL，LNFP-Ⅱ，LNFP-Ⅲ，LNDFH-Ⅱ的水平較高。亞洲人群中存在Le(a+,b+)型，其FUT2酶部分失活[16]，但依據(jù)母乳中性寡糖的水平中難以判斷，這可能導(dǎo)致在分型時(shí)將該型也歸為L(zhǎng)e(a+,b-)。

圖1 凝膠層析提純中性寡糖

圖2 中性寡糖色譜分析示意圖

Fig 2 HPLC analysis of neutral oligosaccharide

Notes A: standard; Pool1:B：little 3-FL in Le(a-,b-);C：3-FL and 2′-FL in Le(a-,b+);D：little 2′-FL in Le(a+,b-). Pool2:B：little LNDFH-Ⅱ、LNFP-Ⅱ+Ⅲ in Le(a-,b- );C：LNDFH-Ⅱ,LNDFH-Ⅰ,LNFP-Ⅰ and LNFP-Ⅱ+Ⅲ in Le(a-,b+);D：little LNDFH-Ⅰ and LNFP-Ⅰ in Le(a+,b-)

1.6 FUT2的SNP位點(diǎn)rs1047781多態(tài)性檢測(cè)

1.6.1 儀器與設(shè)備 NanoDrop ND-1000紫外分光光度計(jì)(美國(guó)NanoDrop Technologies公司)；PCR儀2700(美國(guó)Applied Biosystem公司)；3130測(cè)序儀(美國(guó)Applied Biosystem公司)。

1.6.2 試劑 DNA Self-collection Kit(加拿大DNA Genotek公司)；Hidi(美國(guó)Applied Biosystem公司)；Bigdye(美國(guó)Applied Biosystem公司)；5×seqbuffer(美國(guó)Applied Biosystem公司)；10×buffer(瑞士Roche公司)；EXONI(美國(guó)Promega公司)；SAP(美國(guó)Promega公司)。

1.6.3 實(shí)驗(yàn)步驟 母親唾液按標(biāo)準(zhǔn)流程提取DNA。擴(kuò)增FUT2基因引物序列：正向: 5′-GCCCCCATC-TTCAGAATCAC-3′； 反向:5′-AGCAAACACCACATCACCGT-3′。測(cè)序反應(yīng)體系96℃預(yù)變性10 s，進(jìn)入熱循環(huán)，變性96℃10 s，退火50℃ 5 s，延伸64℃ 4 min，共循環(huán)25次，64℃終延伸4 min。經(jīng)洗滌烘干，離心后用ABI 3130測(cè)序儀測(cè)序，獲取測(cè)序結(jié)果。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。多樣本均數(shù)之間的比較采用多個(gè)獨(dú)立樣本的Kruskal-Wallis檢驗(yàn)，兩樣本均數(shù)的比較采用兩個(gè)獨(dú)立樣本的Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 2008年3～12月在上海國(guó)際和平婦嬰保健院產(chǎn)科住院的健康母親110名進(jìn)入研究。年齡22～44歲，平均(29.4±3.8)歲；身高143～179 cm，平均(167±6)cm。

78/110名進(jìn)行母乳中性寡糖水平檢測(cè)，其中30例在復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院采用本研究建立的方法測(cè)定，余48例由美國(guó)麻省總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室采用其實(shí)驗(yàn)室的方法進(jìn)行分析；考慮實(shí)驗(yàn)方法及儀器可能存在差異，且本研究的方法缺乏內(nèi)參行回收率校正，故在按基因分型分組比較時(shí)，將數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為各中性寡糖水平占所測(cè)總中性寡糖水平的比值再行分析。

2.2 Lewis表型的分布 根據(jù)母乳中性寡糖檢測(cè)結(jié)果確定Lewis表型，Le(a-,b-)占21.8%(21/78名)，Le(a-,b+)占51.3%(17/78名)，Le(a+,b-)占26.9%(40/78名)。

2.3 FUT2 的SNP位點(diǎn)rs1047781多態(tài)性檢測(cè) FUT2是編碼α1,2連接鍵的巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的基因，該基因上的SNP位點(diǎn)rs1047781存在A/T兩種變異，在人群中存在AA，AT和TT 3種基因型(圖3)。105/110名母親的唾液樣本成功提取DNA完成測(cè)序，48.6%(51名)為雜合AT基因型，26.7%(28名)為純合AA基因型，24.8%(26名)為TT基因型。任意選取其中的50例樣本進(jìn)行重復(fù)檢測(cè)，誤差率為0。

圖3 SNP位點(diǎn)rs1047781測(cè)序圖

Fig 3 Sequence containing SNP on gene FUT2

Notes A:AA;B:AT;C:TT

2.4 母親SNP位點(diǎn)rs1047781多態(tài)性與中性寡糖水平關(guān)系 同時(shí)完成母乳中性寡糖檢測(cè)及SNP多態(tài)性分析的樣本共60例。行Hardy-Weinberg平衡檢測(cè)(P=0.78)，提示符合Hardy-Weinberg平衡。按不同基因型分組分析，AA型母親α1,2連接的巖藻糖寡糖含量豐富；TT型母親α1,2連接的巖藻糖寡糖含量很少(P<0.01)；AT型母親α1,2連接的巖藻糖寡糖濃度介于兩者之間(圖4)。

圖4 不同基因型母乳α1,2連接巖藻糖基寡糖水平/總中性寡糖水平

Fig 4 ɑ1,2-linked oligosaccharides/total oligosaccharides of human milk

3 討論

3.1 母乳中性寡糖的Lewis表型 母乳寡糖健康促進(jìn)作用的基礎(chǔ)很大程度上依賴于特殊的寡糖基序。結(jié)構(gòu)變化可以產(chǎn)生無數(shù)母乳寡糖的不同結(jié)構(gòu)，人類母乳至少含有數(shù)千種寡糖。Ninonuevo等[17]指出，在人類母乳總樣本中已鑒定出大約200種母乳寡糖分子，其中主要是含有巖藻糖基的中性寡糖，巖藻糖基的連接可以有ɑ1,2、ɑ1,3和ɑ1,4等方式，完成不同連接方式相應(yīng)的酶為ɑ1,2、ɑ1,3和ɑ1,4連接酶。研究認(rèn)為ɑ1,2連接酶是由FUT2基因編碼合成，而ɑ1,3和ɑ1,4連接酶可以由FUT3基因編碼合成[18]。

本研究和其他的相關(guān)研究都發(fā)現(xiàn)，不同泌乳期母親母乳中性寡糖水平存在很大的個(gè)體差異和人群差異[15，19]，而且即使是同一人在不同泌乳期也有很大的不同[20，21]。Erney等[22]分析了不同地理分布泌乳期人群的乳汁樣本，發(fā)現(xiàn)中性寡糖的水平存在地域性差異。在本研究前期發(fā)現(xiàn)，與課題合作方提供的美國(guó)母親的數(shù)據(jù)相比，中國(guó)母親母乳中性寡糖的水平明顯偏低。

根據(jù)母乳中性寡糖種類和水平分類，本研究中檢測(cè)的母乳樣本中Lewis表型Le(a-,b-)、Le(a-,b+)和Le(a+,b-)分布與中國(guó)浙江省人群[23]的分布相似，而根據(jù)母乳中性寡糖分布特點(diǎn)會(huì)將Le(a+,b+)也歸為L(zhǎng)e(a+,b-)，故導(dǎo)致本研究中Le(a+,b-)母親的比例偏高。

因Le(a-,b-)，Le(a-,b+)型約占總?cè)巳旱?0%，而該兩型的母親體內(nèi)均有α1,2巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)，故整體而言，母乳中ɑ1,2連接的巖藻糖基寡糖的水平明顯高于α1,3和α1,4巖藻糖基寡糖。有國(guó)外相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道證實(shí)α1,2連接的巖藻糖基寡糖具有更重要的生物學(xué)意義[24，25]，其在哺乳期早期的高表達(dá)可能也與其重要的生物學(xué)功能相關(guān)。在前期研究中發(fā)現(xiàn)中國(guó)母親母乳中各中性寡糖在產(chǎn)后2、4 和13 周變化差異很大[21]，其中2′-FL與3′-FL 持續(xù)上升，而LNFP-Ⅰ則持續(xù)下降，LNFP-Ⅱ，LNFP-Ⅲ，LNDFH-Ⅰ無明顯變化。母乳中性寡糖隨時(shí)間變化產(chǎn)生的差異，也提示了某些特定種類的中性寡糖對(duì)嬰兒健康可能具有更重要的促進(jìn)作用。

3.2 FUT2的SNP位點(diǎn)rs1047781多態(tài)性對(duì)母乳巖藻糖寡糖水平的影響 本研究選取了FUT2的另一個(gè)SNP位點(diǎn)rs1047781進(jìn)行研究。觀察到FUT2的SNP位點(diǎn)rs1047781 A/T多態(tài)性可影響母乳中α1,2連接巖藻糖基寡糖的表達(dá)。AA基因型母親因?yàn)椴荒芫幋aα1,3和α1,4巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶，因此母乳中α1,3或α1,4連接巖藻糖基寡糖水平非常低；另外，母乳中可能由于缺乏與α1,2巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶競(jìng)爭(zhēng)底物的酶，使α1,2連接巖藻糖基寡糖水平較高。相反，TT基因型母親母乳中α1,3和α1,4連接巖藻糖基寡糖水平豐富，而α1,2連接巖藻糖基寡糖水平較低。AT基因型母親α1,3和α1,4連接巖藻糖基寡糖的水平，α1,2連接巖藻糖基寡糖的水平都介于AA型和TT基因型母親之間。本研究結(jié)果可以推測(cè)，F(xiàn)UT2基因SNP位點(diǎn)rs1047781具A/T多態(tài)性，是控制中國(guó)母親表達(dá)α1,2連接巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的關(guān)鍵位點(diǎn)。

本研究的不足之處和局限性：本課題在實(shí)驗(yàn)方法學(xué)上進(jìn)行了嘗試，但檢測(cè)效率較低，單樣本耗時(shí)太長(zhǎng)，完整分析一個(gè)樣本約需24 h，且無內(nèi)參進(jìn)行回收率校正，僅為半定量檢測(cè)。同時(shí)，母乳樣本收集的時(shí)間，母乳的保存時(shí)間，母親的身體狀態(tài)，都有可能對(duì)母乳中性寡糖水平產(chǎn)生影響。故在實(shí)驗(yàn)方法學(xué)上尚需進(jìn)一步完善。目前針對(duì)中國(guó)母親母乳中性寡糖的研究報(bào)道罕見，進(jìn)一步的研究有賴于更大樣本及較長(zhǎng)時(shí)間的縱向隨訪。

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