李 慧,蒲 鑫,武 蕓,丁 莉*

(1.湖北民族學(xué)院 生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,湖北 恩施 445000;2.湖北省生物資源保護(hù)與利用重點(diǎn)實(shí)驗室(湖北民族學(xué)院),湖北 恩施 445000)

川續(xù)斷為雙子葉植物綱菊亞綱川續(xù)斷目川續(xù)斷科植物.因產(chǎn)地湖北五峰縣、鶴峰縣的品質(zhì)優(yōu)良，資源豐富，常被稱作“五鶴續(xù)斷”，是常用的中藥之一，具有補(bǔ)肝益腎，續(xù)接筋骨，抗骨質(zhì)疏松，止血安胎等功效.川續(xù)斷中含有揮發(fā)油、生物堿、多糖、蛋白質(zhì)和多種重金屬離子等主要有效成分.關(guān)于川續(xù)斷植物的研究主要集中在道地歷史考證、有效成分及藥理作用等，分子生物學(xué)方面的研究甚少[1-2].另外，在對川續(xù)斷進(jìn)行研究時，發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地的植株之間光合能力和同工酶方面存在差異[3-4]，從分子水平探討其是否存在遺傳方面差異尚未見研究.

為了發(fā)掘新的川續(xù)斷種質(zhì)資源，培育川續(xù)斷新品種，本試驗以恩施州8個不同產(chǎn)地的川續(xù)斷單株為研究材料，采用RAPD技術(shù)進(jìn)行了聚類分析，從而研究材料間的遺傳學(xué)差異，旨在為今后進(jìn)一步開發(fā)利用川續(xù)斷提供參考[5].

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料來源見表1.

表1 供試材料來源

1.2 試劑與儀器

Taq DNA聚合酶購自Promega(上海)；dNTPs(2.5 mmol/L each)；Tris base為武漢天源生物技術(shù)有限公司分裝的Amresco;RAPD隨機(jī)引物購自上海生工生物工程有限公司,瓊脂糖產(chǎn)于spain的Biowest Agarose；DL3000 DNA Marker購自上海雷浩信息科技有限公司,其他試劑均為國產(chǎn)分析純生化試劑.

飛鴿牌GL-16G-A高速冷凍離心機(jī)，BIORAD凝膠成像系統(tǒng)，BeckmanD/U530紫外分光光度計，新飛BCD-219冰箱V，Biohit proline移液槍，美國ABI2720型PCR擴(kuò)增儀，DYY-10C型電泳儀(北京市六一儀器廠)，HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋.

1.3 基因組DNA提取與濃度檢測.

以CTAB法提取上述材料，參照李合生等的方法[5].

取上述方法提取的基因組DNA 30 μL，稀釋100倍，在紫外分光光度計上測A230、A260、A280，根據(jù)DNA濃度(μg/mL)=50×OD260 nm×稀釋倍數(shù)，確定DNA母液濃度，進(jìn)而按50 ng/μL進(jìn)行稀釋.

1.4 PCR擴(kuò)增與產(chǎn)物檢測

反應(yīng)采用20 μL的PCR體系，其中模板DNA濃度 為50 ng/μL，引物濃度為1.0 μmol/L，Mg2+濃度為2.5 mmol/L的，dNTP各0.2 mmol/L,Taq酶1.0 U，39℃的退火溫度在ABI2720型PCR擴(kuò)增儀中進(jìn)行反應(yīng).反應(yīng)程序為:94℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s, 39℃退火40 s, 72℃延伸2 min,43個循環(huán);最后72℃延伸10 min,4℃保存.得到的產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，EB中染色30 min，凝膠成像系統(tǒng)照相保存.

1.5 數(shù)據(jù)分析

對擴(kuò)增后電泳帶的總數(shù)及多態(tài)性帶數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計，按照Nei[6]的公式，根據(jù)材料間譜帶的數(shù)目，求出各自材料間的相似系數(shù)：R=2Nxy/(Nx+Ny)；其中R為材料x和y的相似系數(shù)，Nxy代表材料x和y經(jīng)RAPD擴(kuò)增后所共有的條帶數(shù)目，Nx和Ny分別代表x和y材料分別具有的總擴(kuò)增條帶數(shù).并根據(jù)在某一位點(diǎn)形成譜帶記為1，某一位點(diǎn)未形成譜帶記為0，構(gòu)建8個產(chǎn)地續(xù)斷基于RAPD擴(kuò)增的譜帶原始二態(tài)數(shù)據(jù)矩陣，利用NTSYS(2.01)軟件進(jìn)行聚類分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組DNA提取結(jié)果

采用CTAB法提取的DNA條帶較均一，無降解彌散的現(xiàn)象.說明CTAB法適合五鶴續(xù)斷基因組DNA的提取，這與其他研究結(jié)果一致[7].

2.2 RAPD擴(kuò)增結(jié)果

通過對RAPD反應(yīng)體系各重要因素的優(yōu)化，從50條隨機(jī)引物中篩選出了擴(kuò)增條帶豐富、多態(tài)性好的5條引物序列，并發(fā)現(xiàn)這些序列的G/C含量都在50%以上(見表2).圖1、2為引物P7、P9對8份材料的擴(kuò)增結(jié)果.RAPD統(tǒng)計結(jié)果表明，5條引物總共擴(kuò)增出53條電泳譜帶，得到的DNA片斷大小為300～2 500 bp.其中，引物P7擴(kuò)增的帶中，所有材料在1 000 bp和1 600 bp處有共有帶，其余條帶均為多態(tài)性帶.綜合各引物的擴(kuò)增帶，得到8份材料川續(xù)斷的分子識別表(見表3).引物P9擴(kuò)增出的14條帶中，所有材料在DNA片段100、600、800、1600、1 800、2 000、2 300 bp處均有共同的條帶，在DNA片段400 bp處，只有建始縣龍坪、鶴峰縣太平鄉(xiāng)和鶴峰縣五里坪在這個位點(diǎn)上形成條帶(圖1、2)，其他產(chǎn)地的續(xù)斷在這個位點(diǎn)上均未形成帶.

表2 篩選出的引物及其序列

圖1 P7引物的擴(kuò)增效果 圖2 P9引物的擴(kuò)增效果 Fig.1 Amplification products of primer P7 Fig.2 Amplification products of primer P9

產(chǎn)地總譜帶數(shù)可與其他產(chǎn)地區(qū)別的位點(diǎn)產(chǎn)地總譜帶數(shù)可與其他產(chǎn)地區(qū)別的位點(diǎn)建始縣龍坪鄉(xiāng)251900bp利川市元堡鄉(xiāng)25—恩施市魚塘壩上壩25—恩施市魚塘壩硒礦區(qū)23—巴東縣綠蔥坡24—恩施市雙河鄉(xiāng)19—鶴峰縣太平鄉(xiāng)231500bp鶴峰縣五里坪23—

2.3 相似系數(shù)的分析

由表4可見，8個產(chǎn)地基于RAPD擴(kuò)增反應(yīng)得到的條帶之間相似系數(shù)差異較小，波動的幅度在0.81～0.96，說明材料間親緣關(guān)系較近，變異較小.

表4 續(xù)斷基因型相似系數(shù)對稱性矩陣

圖3 基于RAPD的續(xù)斷聚類分析圖Fig.3 Dendrogram by cluster analysis of Dipsacus asper by RAPD

2.4 個體水平的聚類分析

由圖3可以看出，利用RAPD方法，根據(jù)相似系數(shù)的聚類結(jié)果，在聚類距離0.85左右，可將8份川續(xù)斷材料分為三大類.第Ⅰ大類包括川續(xù)斷1號(建始縣龍坪)、川續(xù)斷2號(利川市元堡)、川續(xù)斷3號(恩施市魚塘壩上壩)、川續(xù)斷4號(恩施市魚塘壩硒礦區(qū))、川續(xù)斷5號(巴東縣綠蔥坡)；第Ⅱ包括川續(xù)斷7號(鶴峰縣太平鄉(xiāng))和川續(xù)斷8號(鶴峰縣五里坪)；川續(xù)斷6號(恩施市雙河)獨(dú)立分為一類.

3 討論

RAPD分子標(biāo)記技術(shù)因為具有可供選擇標(biāo)記數(shù)量多、無器官和發(fā)育時期的特異性等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于生物的遺傳多樣性及親緣關(guān)系研究，特別適用于近緣屬級以下(包括近緣屬間)的研究[8].

從本研究的RAPD電泳圖譜可以看到，8個不同產(chǎn)地的川續(xù)斷材料的主要譜帶基本一致，說明它們的親緣關(guān)系很近，但次譜帶間又存在著較細(xì)微的差異，說明存在一定的遺傳多樣性.根據(jù)遺傳關(guān)系聚類分析，地理位置很近的恩施市魚塘壩上壩、恩施市魚塘壩硒礦區(qū)和恩施市雙河的川續(xù)斷沒有分成一類，可能是由于前兩者處于硒礦區(qū)，而硒在植物生長中有很重要的作用[9-10].除此之外，本實(shí)驗的分類結(jié)果基本以地理分布為主，地理位置越接近的，親緣關(guān)系越近，之間的差異就較小，所以不同的生境是影響川續(xù)斷不同性狀的主要原因之一.另外，在對不同產(chǎn)地的續(xù)斷的過氧化物同工酶研究中，將8份材料分為了2大類，與本研究的分類結(jié)果基本一致，說明這種分析方法是可行的.

利用分子生物學(xué)方法研究恩施州內(nèi)的川續(xù)斷的種質(zhì)資源，從分子水平揭示其親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近，不僅可以為川續(xù)斷的系統(tǒng)選育和引種栽培提供理論依據(jù)，還可以為進(jìn)一步研究川續(xù)斷種質(zhì)資源的起源和進(jìn)化問題提供參考.

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