AN221 HPLC-UV、Acclaim混合基質(zhì)柱WCX-1快速檢測(cè)液體奶和奶粉中的三聚氰胺

戴安(DIONEX)儀器分析園地

三聚氰胺是一種用于塑料和化學(xué)肥料生產(chǎn)的化學(xué)原料.最近出現(xiàn)了一些嬰兒食品(奶粉)被三聚氰胺污染的現(xiàn)象.不法分子通過(guò)摻加三聚氰胺來(lái)提高奶粉中蛋白質(zhì)測(cè)定量，三聚氰胺也被摻到動(dòng)物飼料中以提高蛋白質(zhì)測(cè)定量.

三聚氰胺的定量檢測(cè)方法有酶免疫測(cè)定法(EIA)、GC-MS、LC-MS、HPLC-UV等.中國(guó)政府頒布的檢測(cè)原奶和奶制品中三聚氰胺檢測(cè)方法包括了HPLC-UV、LC-MS和GC-MS，但是GC/LC-MS的正常運(yùn)行需要很高的成本，并且GC-MS樣品衍生化需要較高的勞動(dòng)強(qiáng)度，這樣就限制了該標(biāo)準(zhǔn)在奶制品企業(yè)中的推廣應(yīng)用，因此HPLC-UV方法仍是目前在奶制品企業(yè)中普及的檢測(cè)方法.針對(duì)大批量需要檢測(cè)的原奶，推薦另一種HPLC-UV方法快速檢測(cè)原奶，但是該方法在奶制品的檢測(cè)中具有局限性.

本文介紹一種簡(jiǎn)單的HPLC方法，同時(shí)快速檢測(cè)液體奶和奶粉中三聚氰胺.該方法使用Acclaim混合基質(zhì)WCX-1色譜柱、UltiMate? 3000 HPLC-UV高效液相色譜、醋酸鹽緩沖液和乙腈為流動(dòng)相進(jìn)行檢測(cè).單個(gè)樣品10 min內(nèi)完成分析.Acclaim混合基質(zhì)WCX-1色譜柱使用硅膠基質(zhì)，其分離原理含有疏水和弱離子交換特點(diǎn)，對(duì)離子化和中性的化合物表現(xiàn)出了很好的分離特性.使用UltiMate? 3000 HPLC-UV高效液相色譜和Acclaim混合基質(zhì)WCX-1色譜柱能同時(shí)快速分析液體奶和奶粉中的三聚氰胺.

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 儀器與試劑

儀器:Dionex UltiMate 3000 HPLC系統(tǒng)包括有HPG 3400A泵，WPS 3000TSL自動(dòng)進(jìn)樣器，TCC-3000柱溫箱，VWD-3400RSUV-Vis檢測(cè)器.Dionex SummitUVD-340U PDA，Chromeleon? 6.80 SP5工作站.Kudos? SK3200LH 超聲波發(fā)生器(KudosUltrasonic Instrumental Co.，Shanghai，China)，梅特勒 Toledo AL-204 電子天平(梅特勒(上海)公司，上海)，Anke?TGL-16B離心機(jī)(Anting科學(xué)儀器公司，上海)，IKA? MS1微型振蕩器(廣州)

試劑與標(biāo)準(zhǔn)品:水，Milli-Q? Gradient A 10;甲醇(CH3OH)，HPLC級(jí)，F(xiàn)isher;乙腈(CH3CN)，HPLC級(jí)，F(xiàn)isher;醋酸銨(NH4Ac)，分析純，SCRC，China;醋酸(HAc)，分析純，SCRC，China;辛烷磺酸鈉 (98%)，色譜純，USA;三聚氰胺(99.0%)，HPLC 級(jí)，F(xiàn)luka.

色譜條件:保護(hù)柱:Acclaim混合基質(zhì)WCX 1，5μm，4.3 mm ×10 mm，P/N 068354，預(yù)柱，P/N 59526;分析柱:Acclaim混合基質(zhì)WCX-1，5μm，4.6 mm ×250 mm，P/N 068352;柱溫:30℃;流動(dòng)相:醋酸鹽緩沖系統(tǒng) (700 mL，10 mmol·L－1HAc 和 300 mL，10 mmol·L－1NH4Ac 混合，pH 4.3)-CH3CN(8∶2，V/V);流速:1.0 mL·min－1;進(jìn)樣體積:20μL;紫外檢測(cè)器:吸收波長(zhǎng)240 nm.

1.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液:精密稱(chēng)定100 mg的三聚氰胺，用50%甲醇水溶液定容在100 mL容量瓶中，得到三聚氰胺濃度為1000 μg·mL－1.

標(biāo)準(zhǔn)溶液:制備7份標(biāo)樣用來(lái)校準(zhǔn)，每個(gè)標(biāo)樣加入一定量的標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，醋酸水溶液流動(dòng)相稀釋?zhuān)矍璋返臐舛确謩e是 0.05、0.1、0.2、1.0、5.0、20 和 40 μg·m L－1.

奶粉樣品:加入1 g左右精確稱(chēng)重的干燥奶粉樣品至15 mL離心管，添加10 mL水，渦流振蕩1 min后，超聲波超聲30 min.取出，滴加1 mL乙酸溶液(3%，V/V)，4℃下放置至少30 min后，離心15 min(10000 r·min－1)，移取上清液至10 mL容量瓶中，水定容至刻度，進(jìn)樣前，0.2μm微孔濾膜過(guò)濾.

液體奶樣品:精確量取10 mL液體奶樣品至15 mL體積離心管后，直接加入1 mL的的乙酸(3%，V/V)洗脫液，4℃下靜置30 min.余下操作步驟同奶粉樣品處理.

奶粉和液體奶加標(biāo)回收:加入40μL三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液至15 mL離心管中，分別加入已精確稱(chēng)定1 g左右的干燥奶粉和精確量取10 mL左右的液體奶，余下步驟同奶粉和液體奶的操作.

2 結(jié)果與討論

2.1 優(yōu)化牛奶和奶粉樣品的制備過(guò)程

一般處理牛奶和奶粉樣品分兩個(gè)步驟，樣品提取和SPE小柱凈化，50℃ N2吹干.離子交換分析法(IEX)的處理方法比此更簡(jiǎn)便，但是只適用于液體奶檢測(cè).因此開(kāi)發(fā)一種高效而更簡(jiǎn)便并同時(shí)處理牛奶和奶粉的方法十分必要.我們開(kāi)發(fā)的方法不需要過(guò)SPE小柱和樣品干燥，只需加入乙酸洗脫液，離心，過(guò)濾，該方法同時(shí)適用于液體奶和奶粉檢測(cè)，也適用反相離子對(duì)色譜方法(RP-PIC)分析.圖1表明，三聚氰胺檢測(cè)波長(zhǎng)240 nm，該樣品制備方法無(wú)論使用Acclaim混合基質(zhì)WCX-1色譜柱或者RP-PIC方法的Acclaim 120 C18色譜柱，都能得到很好的三聚氰胺圖譜，目標(biāo)峰無(wú)雜質(zhì)峰干擾.

圖1 牛奶樣品和牛奶樣品加標(biāo)圖譜(A.Acclaim混合基質(zhì)WCX-1色譜圖;B.Acclaim 120 C18色譜圖)

2.2 優(yōu)化色譜條件

三聚氰胺是親水性成分，在經(jīng)典RP反相色譜柱(例如C18或C8)中保留較弱，大多數(shù)反相柱使用離子對(duì)試劑，流動(dòng)相中添加離子對(duì)試劑，例如辛烷磺酸鹽，三聚氰胺就能很好地保留.然而，離子對(duì)試劑可能會(huì)污染固定相，會(huì)改變反相柱的保留性能，如果這根色譜柱換成其它分離方法時(shí)，可能就得不到原色譜峰.RP-PIC方法通常不適合同MS檢測(cè)器連接，因此嘗試在Acclaim混合基質(zhì)WCX-1色譜柱上分離離子化的三聚氰胺，醋酸緩沖鹽洗脫.

Acclaim混合基質(zhì)WCX-1色譜柱特性是混合硅膠基質(zhì)填料，同時(shí)具有疏水性和弱離子交換特性，流動(dòng)相pH值能影響到固定相的電荷數(shù)和疏水性，當(dāng)流動(dòng)相pH值低于固定相羧酸根的p Ka值時(shí)，離子交換作用失活，因此疏水作用成為保留機(jī)制的主要作用.當(dāng)流動(dòng)相pH高于固定相p Ka值時(shí)，離子交換作用激活，因此兩種分離機(jī)制都對(duì)被分析物的保留有影響，保留時(shí)間取決于分析物特性.大量實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，流動(dòng)相緩沖鹽pH值低于3.5或大于5.0時(shí)，三聚氰胺都沒(méi)有被很好地保留.離子交換作用是能改變帶電荷化合物在色譜柱中保留的關(guān)鍵因素，在堿性環(huán)境中流動(dòng)相離子濃度增加后，三聚氰胺保留時(shí)間降低;疏水性保留特性明顯受有機(jī)相比例影響，增加有機(jī)相比例后，其它的條件(例如離子作用力、pH、溫度等)保持不變，所有種類(lèi)的分子(酸、堿和中性化合物)保留時(shí)間都會(huì)提前.

針對(duì)液體奶和奶粉樣品，流動(dòng)相為10 mmol·L－1醋酸銨，pH=4.3，20%MeCN.對(duì)于更復(fù)雜的樣品，應(yīng)當(dāng)使用更強(qiáng)緩沖能力的緩沖鹽溶液，同時(shí)三聚氰胺的保留時(shí)間提前，而減少流動(dòng)相中乙腈的比例不大可能恢復(fù)原來(lái)的保留時(shí)間位置.

2.3 色譜性能

圖2為三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品溶液5次連續(xù)進(jìn)樣色譜圖，每次進(jìn)樣20μg·mL－1，保留時(shí)間和峰面積重復(fù)性良好.三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)曲線由7個(gè)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液制得，每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)液重復(fù)進(jìn)樣5次.標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣品定量使用外標(biāo)法，如圖3，線性范圍0.05—40 μg·mL－1，線性方程為:A=0.9120C，相關(guān)系數(shù)0.9999，曲線通過(guò)原點(diǎn).

圖2 5次20μg·mL－1三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液連續(xù)進(jìn)樣重疊圖

圖3 三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)曲線

重復(fù)性方法學(xué)考察通過(guò)10次連續(xù)進(jìn)樣1μg·mL－1標(biāo)準(zhǔn)品溶液.保留時(shí)間RSD為0.037，峰面積的RSD為0.472.三聚氰胺檢測(cè)限MDL計(jì)算公式:式中，S=重復(fù)分析標(biāo)準(zhǔn)差，n=重復(fù)次數(shù)，t(n－1，1－α=0.99)=置信度99%、自由度 n－1的Student's t值.1 μg·mL－1標(biāo)準(zhǔn)品溶液重復(fù)進(jìn)樣10 次計(jì)算的檢測(cè)限 MDL 為0.015 μg·mL－1.

2.4 樣品分析

取5份樣品，包括3份奶粉(1#—3#)和2份液體奶(4#和5#)，用新前處理方法和WCX色譜法進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，1#樣品中沒(méi)有檢測(cè)到三聚氰胺，而其它5份樣品都檢測(cè)到了三聚氰胺.圖4顯示了所有色譜圖.另在1#和4#樣品處理前加標(biāo)樣三聚氰胺，結(jié)果兩個(gè)樣品出現(xiàn)了明顯的三聚氰胺色譜峰.

圖4 色譜圖 (A.奶粉1#— 3#;B.液體奶4#和5#)

2.5 樣品制備和分析方法的對(duì)比

取3份奶粉樣品，1#—3#，和另外3份奶粉樣品6#—8#，分別使用我們的新方法和活化SPE小柱的奶粉檢測(cè)方法(GB/T 22388 2008)，制備后的樣品分別用Acclaim 120 C18色譜柱、GB/T 22388 2008色譜條件分析方法A和Acclaim混合基質(zhì)WCX-1色譜柱、以上述色譜條件分析分析方法B，結(jié)果見(jiàn)表1.全部樣品結(jié)果包括兩種樣品制備過(guò)程和兩種色譜方法的分析，數(shù)據(jù)對(duì)比表明，全部6份樣品使用這兩種樣品制備方法或色譜分離方法后，結(jié)果一致性良好.

表1 牛奶樣品檢測(cè)結(jié)果對(duì)比(mg·kg－1)

對(duì)于復(fù)雜基質(zhì)的奶制品可能有三聚氰胺假陽(yáng)性，與三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品溶液對(duì)比紫外光譜圖是有效的辦法.分析樣品8#時(shí)，分別使用GB/T 22388 2008中的樣品制備方法和混合基質(zhì)WCX-1色譜柱方法，發(fā)現(xiàn)一個(gè)和三聚氰胺保留時(shí)間接近的小峰，將此峰標(biāo)記為三聚氰胺時(shí)濃度為3.3 mg·kg－1.使用其它樣品處理方法和色譜方法沒(méi)有在該樣品中檢測(cè)到三聚氰胺.在VWD紫外檢測(cè)器后連接一個(gè)PDA陣列檢測(cè)器，對(duì)比紫外光譜圖，如圖5中所示，結(jié)果顯示該色譜峰不是三聚氰胺，使用PDA陣列檢測(cè)器分析有助于減少三聚氰胺假陽(yáng)性誤判.

圖5 UV光譜圖(A.三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液;B.假定的三聚氰胺色譜峰)

3 結(jié)論

本文開(kāi)發(fā)了一個(gè)快速處理檢測(cè)液體奶和奶粉樣品中三聚氰胺的高效簡(jiǎn)便方法.方法使用Acclaim混合基質(zhì)WCX-1色譜柱和醋酸銨緩沖鹽與乙腈為流動(dòng)相的分析方法進(jìn)行檢測(cè)，三聚氰胺得到很好地保留，并可同時(shí)兼容MS檢測(cè)器.