施嫣嫣 沈夕坤 袁 琴 陶婷婷

（江蘇省蘇州市中醫(yī)醫(yī)院，南京中醫(yī)藥大學(xué)蘇州附屬醫(yī)院，江蘇 蘇州 215000）

肝癌是一種嚴(yán)重威脅人類健康和生命的惡性腫瘤，發(fā)病率逐年上升［1］。目前針對肝癌的治療方法主要包括手術(shù)、放療、化療等，但是手術(shù)切除適用范圍小且易復(fù)發(fā)，放化療手段常伴有骨髓抑制及肝、腎、胃腸道等嚴(yán)重不良反應(yīng)［2-3］。因此，開發(fā)出高效、低毒的新型抗腫瘤藥物顯得尤為重要。

近年來，傳統(tǒng)中藥以其高效、低毒和多靶點(diǎn)的優(yōu)勢，在改善患者臨床癥狀、防止復(fù)發(fā)、抑制瘤體的生長、延長生存期等方面發(fā)揮了獨(dú)特的作用，成為腫瘤綜合治療手段中必不可少的組成部分［4-5］。自上個世紀(jì)70年代末于昆蟲體內(nèi)發(fā)現(xiàn)抗菌肽 （Antimicrobial peptides）以來，僅昆蟲類的抗菌肽迄今已發(fā)現(xiàn)100多種，抗菌肽

具有廣譜抗菌作用，隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)其中一部分抗菌肽還具有明顯的抗腫瘤活性［6-7］。新疆家蠶抗菌肽CecropinXJ屬于天蠶素-B類家族，具有很強(qiáng)的熱穩(wěn)定性，抗菌譜廣，有報道證實(shí)Cecropins家族的抗菌肽可以有效地殺傷腫瘤細(xì)胞［8-9］。本文通過體內(nèi)外方式驗(yàn)證CecropinXJ抑制肝癌細(xì)胞生長的功能并探討其機(jī)制，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 動物與細(xì)胞 SPF級裸鼠20只，雄性，體質(zhì)量18~20 g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司提供，許可證號：SCXK（滬）2015-0005。BEL-7402和 LO2細(xì)胞由中國科學(xué)院上海生科院細(xì)胞資源中心提供。

1.2 藥物與試劑 RPMI-1640，Gibco公司；胎牛血清，Gibco公司；胰蛋白酶，Gibco公司；青霉素、鏈霉素，Sigma公司；ECL化學(xué)發(fā)光試劑，Thermo公司；Bax（D2E11） Rabbit mAb，Bcl-2 （124） Mouse mAb，Cleaved Caspase-3 （Asp175） （5A1E） Rabbit mAb，Caspase-3 Antibody，β-Actin （13E5） Rabbit mAb，Anti-mouse IgG，HRP-linked Antibody，Anti-rabbit IgG，HRP-linked Antibody，均來自 Cell Signaling Technology；CexropinXJ由上海吉爾生化公司合成，用RPMI-1640配置成質(zhì)量濃度為1 mg/mL，通過0.22 μm濾膜過濾備用。

1.3 BEL-7402細(xì)胞存活率試驗(yàn) 取對數(shù)生長期BEL-7402細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104個/mL，將其均勻鋪至96孔板中，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)約24 h，吸棄孔中上清液，用PBS洗1~2遍，加入不含血清的培養(yǎng)基稀釋得到的一系列濃度CecropinXJ藥液，每個濃度設(shè)置6個復(fù)孔。置于培養(yǎng)箱中孵育48 h后，棄上清，用PBS洗2遍，接下來向每孔中加入10 μL CCK-8試劑和90 mL無血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)30 min，用酶標(biāo)儀測定各孔在450 nm處的OD值，實(shí)驗(yàn)中同時設(shè)立正常細(xì)胞對照組和空白對照組。

1.4 造模與分組 將BEL-7402細(xì)胞置于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長至約85%時，收集對數(shù)生長期細(xì)胞，調(diào)整密度為1×107個/mL。將裸小鼠腋下皮膚消毒后在右腋下接種約0.2 mL腫瘤細(xì)胞懸液，每天觀察裸鼠，接種1周后，待瘤體生長到50 mm3，視為造模成功。將20只成模小鼠隨機(jī)分為模型組和CecropinXJ組，每組10只。模型組予生理鹽水 0.2 mL；CecropinXJ組予 CexropinXJ（0.1 mL，100 μg）；每日腹腔注射1次，連續(xù)給藥15 d，給藥期間所有裸鼠正常飲食。

1.5 標(biāo)本采集與檢測 1）抑瘤率測量。最后1次給藥結(jié)束后次日，脫頸處死小鼠，迅速剝離完整的腫瘤組織，稱瘤質(zhì)量，計(jì)算各藥物組的腫瘤生長抑制率：抑瘤率=（模型組平均瘤質(zhì)量-實(shí)驗(yàn)組平均瘤質(zhì)量）÷模型組平均瘤質(zhì)量×100%。2）小鼠血液及肝腎功能影響的檢測。末次給藥后24 h，對裸鼠稱重，每只腹腔注射0.5%肝素0.5 mL，使肝素化后摘除眼球取血，肝素抗凝全血檢測血兩組小鼠血紅蛋白（Hb）、白細(xì)胞（WBC）和紅細(xì)胞濃度（RBC）。3）凋亡蛋白表達(dá)的檢測。取一定量小鼠腫瘤組織，加入含有10%PMSF的RIPA裂解液，充分研磨后高速冷凍離心，吸取上清后分裝至1.5 mL離心管；用BCA法測定蛋白含量，分裝，保存至-20℃；取部分樣品，用裂解液調(diào)整蛋白濃度至10 mg/mL，按4∶1比例加入5×上樣緩沖液混合，沸水浴5 min，充分變性蛋白，分裝保存至-80℃冰箱備用。進(jìn)行SDSPAGE電泳，轉(zhuǎn)膜后加入5%脫脂奶粉（PBST溶解）封閉2 h；加入一抗孵育，將PVDF膜放入含有抗體的PBST緩沖液中，4℃過夜。一抗回收后，PBST洗3次，分別加入HRP-Goat anti-rabbit和HRP-Goat antimouse的二抗孵育（二抗稀釋比例為1∶1000），將PVDF膜放入含有二抗的PBST緩沖液中，室溫輕搖孵育雜交2 h。二抗回收后，PBST洗3次，每次10 min。PBST倒掉后，加入ECL發(fā)光液，在暗盒中反應(yīng)2～3 min，將PVDF膜用塑料薄膜包好，置于凝膠成像系統(tǒng)拍照。經(jīng)Image Pro Plus軟件處理圖像中蛋白條帶，以光密度進(jìn)行量化分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，采用t檢驗(yàn)比較兩組間差異。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 CecropinXJ對細(xì)胞增殖的影響 見圖1，表1。結(jié)果顯示CecropinXJ多個劑量組均可抑制BEL-7402細(xì)胞的增殖，而且呈藥物濃度依賴性，對人正常肝細(xì)胞（LO2細(xì)胞）無抑制作用。

圖1 CecropinXJ對細(xì)胞增殖的影響

表1 CecropinXJ對細(xì)胞增殖的影響（±s）

表1 CecropinXJ對細(xì)胞增殖的影響（±s）

與模型組比較，**P＜0.01。下同

組別 BEL-7402 LO2模型組 101.24±5.04 102.68±4.31 Cecropin XJ 6.25 μg/mL 組 82.35±1.02** 104.35±2.64 Cecropin XJ 12.5 μg/mL 組 76.36±1.23** 103.82±2.02 Cecropin XJ 25 μg/mL 組 70.01±2.63** 106.32±1.56 Cecropin XJ 50 μg/mL 組 52.75±1.03** 101.78±1.06 Cecropin XJ 100 μg/mL 組 50.30±1.23** 108.46±1.38

2.2 CecropinXJ對BEL-7402移植瘤生長的影響 見表2。整個實(shí)驗(yàn)過程中，小鼠的飲食、活動和生長情況等均良好，模型組小鼠移植瘤生長較快，與模型組比較，CecropinXJ顯著抑制移植瘤的生長，抑瘤率為36.7%。

表2 CecropinXJ對BEL-7402荷瘤小鼠腫瘤生長的影響

2.3 CecropinXJ對小鼠血液系統(tǒng)的影響 見表3。在連續(xù)給藥15 d后，檢測發(fā)現(xiàn)CecropinXJ組小鼠的血紅蛋白、白細(xì)胞和紅細(xì)胞與模型組相比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表3 CecropinXJ對BEL-7402荷瘤小鼠血液的影響（±s）

表3 CecropinXJ對BEL-7402荷瘤小鼠血液的影響（±s）

組 別 WBC（×109/L） RBC（×109/L）模型組 8.50±0.54 7.01±0.61 CecropinXJ組 8.32±0.51 7.13±0.58 n Hb（g/dl）10 13.30±0.85 10 12.89±0.81

2.4 CecropinXJ對凋亡相關(guān)蛋白的影響 見圖2，表4。Western Blotting結(jié)果顯示與模型組比較，Cecropin-XJ可以顯著上調(diào)Bax/Bcl-2的比值（P＜0.01），并顯著上調(diào) Cleaved-Casp3的表達(dá)（P＜0.01）。

圖2 CecropinXJ對凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

表4 CecropinXJ對凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響（±s）

表4 CecropinXJ對凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響（±s）

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3 討 論

隨著中醫(yī)藥治療腫瘤研究的深入，其在延長生存時間、改善生存質(zhì)量等方面的療效已獲得肯定［10-11］。昆蟲類中藥材的應(yīng)用在我國有著悠久的歷史，如斑蝥、水蛭、蜈蚣、蝎子和土鱉蟲等都以各種形式被廣泛用于治療肝癌、肺癌、胃癌、乳腺癌、食道癌和結(jié)腸癌等各種腫瘤的治療［12-13］。作為其主要物質(zhì)基礎(chǔ)的抗菌肽以高效、低毒和在耐藥性方面的優(yōu)勢，使其在抗腫瘤方面有良好的應(yīng)用前景。

本研究發(fā)現(xiàn)新疆家蠶抗菌肽CeceopinXJ能夠在體外顯著抑制肝癌細(xì)胞生長并呈現(xiàn)劑量依賴性，對正常肝細(xì)胞無明顯影響；通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，CeceopinXJ在體內(nèi)抑制肝癌移植瘤的生長，抑瘤率為36.7%；該組小鼠未見有消瘦和厭食等異常，血液檢測結(jié)果和模型組比較也無顯著差異。

細(xì)胞凋亡是一種細(xì)胞主動性死亡模式，在腫瘤的形成和發(fā)展過程中扮演著重要的角色。細(xì)胞凋亡主要有3種途徑，線粒體依賴的細(xì)胞凋亡途徑發(fā)揮著重要的作用，其中Bcl-2家族蛋白占有相當(dāng)重要的地位，其中一類能抑制細(xì)胞凋亡，如Bcl-2和Bcl-xl等，而另外一些蛋白如Bax和Bad可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡，提高Bax與Bcl-2的比值對細(xì)胞凋亡的發(fā)生具有決定性作用［14-15］。

Caspases是一組存在于胞質(zhì)溶膠中的結(jié)構(gòu)上相關(guān)的半胱氨酸蛋白酶，能夠高度選擇性地切割某些蛋白質(zhì)，進(jìn)而活化相關(guān)蛋白。具體參與細(xì)胞凋亡執(zhí)行的是Caspase-3，Caspase-6 和 Caspase-7，其中 Caspase 3 和Caspase 7具有相近的底物和抑制劑特異性，它們降解PARP，導(dǎo)致DNA修復(fù)的抑制并啟動DNA的降解［16-17］。本研究證明CecropinXJ可以顯著抑制上調(diào)Bax/Bcl-2的比值，增強(qiáng)Cleaved-Casp3和cleaved-PARP的表達(dá)。

綜上所述，CecropinXJ可以顯著抑制肝癌BEL-7402細(xì)胞和體內(nèi)移植瘤的生長，同時對正常肝細(xì)胞和血液系統(tǒng)無毒副作用，其機(jī)制與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡相關(guān)。