嚴(yán)會會，胡斌，劉惠民，馬海鳴，王麗杰，石杰*

1.鄭州大學(xué)化學(xué)系，鄭州高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)科學(xué)大道100號450001

2.中國煙草總公司鄭州煙草研究院，鄭州高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)楓楊街2號450001

煙草中農(nóng)藥殘留量的控制是保證煙草制品吸食安全的重要手段，近年來倍受人們關(guān)注。有機磷類農(nóng)藥具有高效、易降解等特點，其種類繁多，廣泛應(yīng)用于各種農(nóng)作物中，在全世界已有70多年的使用歷史[1]。有機磷農(nóng)藥殘留量的分析方法主要有氣相色譜法(GC)[2-4]、氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)[5-7]和高效液相色譜-質(zhì)譜法(LCMS/MS)[8-10]。2003年，美國農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)研究服務(wù)中心的Anastassiades等[11]開發(fā)了QuEChERS(Quick，Easy，Cheap，Effective，Rugged and Safe)方法，用來實現(xiàn)農(nóng)藥多殘留物的高通量分析。其前處理主要采用乙腈提取，分散固相萃取凈化，操作快速、環(huán)保、簡便、價格低廉，主要應(yīng)用于果蔬和谷物中農(nóng)藥多殘留物的檢測[12-15]。目前，應(yīng)用該方法分析煙草中農(nóng)藥多殘留的報道較少[16]。黃琪等[17]用該方法結(jié)合LC-MS/MS分析了煙草中的15種有機磷類農(nóng)藥的殘留?！斑裂镣?、“磺吸磷”等15種有機磷類和雜環(huán)類農(nóng)藥的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)差異較大，其在煙草中的殘留分析目前國內(nèi)尚未見報道。為此，應(yīng)用QuECh-ERS前處理方法，建立了同時快速分析煙草中“吡蚜酮”、“磺吸磷”等15種有機磷類和雜環(huán)類農(nóng)藥殘留的LC-MS/MS方法，以擴充我國煙草中農(nóng)藥殘留分析對象的數(shù)量，并為批量煙草樣品中多種農(nóng)藥殘留的快速分析提供方法參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

空白煙葉樣品，即無農(nóng)藥殘留煙葉樣品，由國際煙草科學(xué)研究合作中心(Cooperation Centre for Scientific Research Relative to Tobacco，CORESTA)和英國FAPAS分析實驗室能力驗證(Food Analysis Performance Assessment Scheme)共同提供。

甲醇(色譜純，美國J.T.Baker公司);乙腈(色譜純，美國ROE公司);氯化鈉(AR，天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司);無水硫酸鎂(AR，天津凱通化學(xué)試劑有限公司)，于600℃馬弗爐中烘烤5 h，儲存于干燥器內(nèi)備用;PSA吸附劑(primary secondary amine，N-丙基乙二胺鍵合固相吸附劑)(Dikma Technologies)。

農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品分別購自美國Sigma，Chem Service和德國Dr Ehrenstorfer GmbH公司。

Agilent 1200高效液相色譜系統(tǒng)(美國安捷倫公司);API4000三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀、Analyst1.4.2數(shù)據(jù)采集處理系統(tǒng)(美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司);Milli-Q50超純水儀(美國Millipore公司);CP2245電子天平(感量0.0001 g，德國Sartorius公司);Sigma 1-15PK高速離心機(德國Sigma公司);0.45 μm有機相針式過濾器(上海安譜科學(xué)儀器有限公司);1.5 mL和50 mL離心管(美國安捷倫公司)。

1.2 樣品處理與分析

準(zhǔn)確稱取2.0 g煙末至50 mL離心管中，加入10 mL水靜置10 min，然后加入10 mL乙腈，手持振蕩1 min，再加入4 g無水硫酸鎂和1 g氯化鈉，立即手持振蕩2 min，于4 000 r/min離心10 min。離心后，移取上清液乙腈層1 mL于1.5 mL離心管中，加入150 mg無水硫酸鎂和25 mg PSA，手持振蕩2 min，于6 000 r/min離心2 min，取上清液200 μL并用流動相稀釋至1 mL，經(jīng)0.45 μm有機相濾膜過濾后進行LC-MS/MS分析。分析條件為:

色譜條件:Waters Atlantis dC18色譜柱(2.1 mm×150 mm i.d.3 μm，美國Waters公司);柱溫:25℃;流速:0.2 mL/min;進樣量:10 μL;流動相A:水;流動相B:乙腈;流動相洗脫梯度:5%B(體積分數(shù))于1 min內(nèi)線性升至95%，于9 min內(nèi)線性降至70%，于2 min內(nèi)降至5%B并保持6 min;質(zhì)譜條件:離子源:電噴霧離子源(ESI);掃描模式:正離子掃描;監(jiān)測模式:多反應(yīng)監(jiān)測(MRM);電噴霧電壓(Ion Spray Voltage，IS):5500 V;霧化氣壓力(GS1，N2):0.413 MPa;輔助加熱氣壓力(GS2，N2):0.345 MPa;駐留時間(Dwell Time):50 ms;離子源溫度(TEM):500℃。15種農(nóng)藥的質(zhì)譜檢測條件見表1。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

該方法所檢測的吡蚜酮等15種農(nóng)藥的極性均較大，易于離子化，適合ESI離子源。選擇Q1全掃描，結(jié)果顯示在正離子掃描模式下，所有化合物的響應(yīng)值明顯優(yōu)于負離子掃描模式，且具有較高的靈敏度。一般化合物都選擇2個離子對，其中干擾少、響應(yīng)較高的離子對作為定量離子對，另一離子對作為輔助定性離子對，如表1所示。

表1 15種農(nóng)藥的質(zhì)譜檢測條件①

2.2 液相色譜條件的優(yōu)化

流動相組成是MS/MS響應(yīng)信號的重要影響因素。為選擇適宜的流動相，考察了甲醇/水體系、乙腈/水體系及不同的流動相洗脫程序。采用乙腈/水體系和甲醇/水體系時分析物的信號強度和出峰情況相似，由于樣品前處理采用乙腈作萃取溶劑，所以選擇乙腈/水體系作為流動相。為提高復(fù)雜樣品的色譜分離和質(zhì)譜鑒定效率，對流動相洗脫梯度進行了優(yōu)化，最終采用的流動相梯度洗脫程序見1.2，優(yōu)化后的MRM離子色譜圖見圖1。

圖1 加標(biāo)水平為1.0 μg/g的空白煙葉樣品的總離子流圖

2.3 提取方法的選擇

QuEChERS法最初是用于蔬菜和水果的前處理，而復(fù)烤后的煙葉與蔬菜水果的最大區(qū)別是含水率低，復(fù)烤后煙葉的含水率在11.2%左右，而新鮮水果和蔬菜的含水率大都在80%左右。所以在操作前，必須補足水分使含水率達到75%以上。比較在加入乙腈提取前，不加水浸潤和分別向2.0 g煙葉樣品中加水2，4，6，8，10，15和20 mL浸潤等8種情況，結(jié)果見表2。

表2 不同加水量樣品的回收率(%)

由表2可知，先加水浸潤煙末，農(nóng)藥更容易游離出來。當(dāng)對2.0 g煙葉樣品的加水量為8和10 mL時，15種農(nóng)藥的回收率均在正常范圍內(nèi)，因此，本實驗采用加水量10 mL。

2.4 基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線與方法的檢出限

為了降低基質(zhì)效應(yīng)帶來的離子抑制或增強作用對定量分析產(chǎn)生的影響，采用空白樣品提取液配制一系列基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進行LC-MS/MS分析，采用外標(biāo)法定量，即用各農(nóng)藥所對應(yīng)的峰面積(y)對其相應(yīng)濃度(x，ng/mL)進行線性回歸分析，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(見表3)。

表3 15種農(nóng)藥的線性方程和檢測限

由表3可知，15種農(nóng)藥在1～100 ng/mL范圍內(nèi)線性良好(R2≥0.9991)，檢出限為0.004～0.030 μg/g，可以滿足定量分析的需要。

2.5 方法的回收率與精密度

分別在2.0 g空白煙葉樣品中添加3個水平的15種農(nóng)藥的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，使各農(nóng)藥含量分別為0.10，0.25和0.50 μg/g。室溫放置1 h后，按照1.2的前處理步驟進行回收率實驗。每個添加濃度平行重復(fù)5次操作，測定精密度，結(jié)果見表4。

由表4可知，15種農(nóng)藥在0.10～0.50 μg/g添加濃度范圍內(nèi)，加標(biāo)回收率為70.43%～117.81%，RSD為1.16%～13.89%。方法的準(zhǔn)確度和精密度均符合農(nóng)藥多殘留分析的要求。

2.6 4種煙葉樣品的分析

測定了由FAPAS(Food Analysis Performance Assessment Scheme)所提供的4種煙葉樣品中的15種農(nóng)藥殘留量。結(jié)果表明，4種煙葉樣品中均檢測出“多菌靈”、“吡蚜酮”、“啶蟲脒”、“異惡草酮和噻蟲嗪”等5種農(nóng)藥，其平均含量分別為0.30，0.0016，0.48，0.11和1.43 μg/g，其余農(nóng)藥未檢出。檢出的各農(nóng)藥含量均低于CORESTA(Cooperation Centre for Scientific Research Relative to Tobacco)于2008年發(fā)布的指導(dǎo)性殘留限量[18]。

表4 15種農(nóng)藥在不同濃度下的精密度和回收率

3 結(jié)論

采用乙腈提取、PSA吸附劑凈化和LC-MS/MS方法對煙草中的吡蚜酮、磺吸磷等15種有機磷類和雜環(huán)類農(nóng)藥殘留進行了快速檢測分析。15種農(nóng)藥在0.10～0.50 μg/g添加濃度范圍內(nèi)，回收率為70.43%～117.81%，RSD為1.16%～13.89%。該方法準(zhǔn)確度較高、重復(fù)性較好，擴充了我國煙草中農(nóng)藥多殘留分析的研究對象，適用于批量煙草樣品的快速分析。

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