張濤, 樸艷, 趙萍, 李熙峰

(長白山生物資源與功能分子教育部重點實驗室(延邊大學),吉林延吉133002)

長白山區(qū)常見藥用植物中常規(guī)成分的檢測及其活性掃描

張濤, 樸艷, 趙萍, 李熙峰＊

(長白山生物資源與功能分子教育部重點實驗室(延邊大學),吉林延吉133002)

利用高效液相色譜法(HPLC法)對長白山地區(qū)常見的100種藥用植物中蘆丁、槲皮素、金絲桃苷、山柰酚、齊墩果酸、熊果酸、β-谷甾醇等常規(guī)成分的含量進行定性定量分析,并且對這些藥用植物提取物的DPPH自由基清除活性和酪氨酸酶抑制活性進行了掃描.結(jié)果顯示:蘆丁、槲皮素、金絲桃苷、山柰酚、齊墩果酸、熊果酸、β-谷甾醇的最高含量分別達到了1.39%、0.34%、1.11%、0.13%、3.12%、12.06%和 7.13%;對酪氨酸酶的抑制率在50%以上的有30種,對DPPH的抑制率在80%以上的有83種.實驗表明,本分析方法簡便、快捷、準確、可靠,可為長白山地區(qū)常見的藥用植物的開發(fā)提供基礎(chǔ)實驗依據(jù).

常規(guī)成分;長白山地區(qū);高效液相色譜法;含量測定;活性掃描

0 引言

長白山地區(qū)植物資源非常豐富,其中藥用植物就達約900余種(包括低等植物)[1],對這些藥用植物開發(fā)一直是國內(nèi)外研究的熱點.鄒盛勤、鄭珺等[2-3]先后建立了同時測定齊墩果酸、熊果酸和槲皮素、山奈酚的分析方法;劉之力、王繼龍等[4-5]分別對54味中藥乙醇提取物和16種長白山野生植物提取物對酪氨酸酶活性抑制作用的進行了研

究.有關(guān)同時測定植物中蘆丁、槲皮素、金絲桃苷、山柰酚、齊墩果酸、熊果酸、β-谷甾醇常規(guī)成分的分析方法以及對長白山區(qū)常見藥用植物提取物的DPPH自由基清除活性及酪氨酸酶抑制活性尚未有文獻報道.本文以長白山區(qū)常見的100種藥用植物做實驗樣品,對這些藥用植物進行常規(guī)成分的含量分析,并對這些植物提取物的DPPH自由基清除活性及酪氨酸酶抑制活性進行了掃描,為研究長白山常見藥用植物中常規(guī)成分的定量分析和活性信息分析提供基礎(chǔ)實驗依據(jù).

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑藥品

Agilent 1100高效液相色譜儀(美國安捷倫公司);VersaMax型酶標儀(美國分子儀器公司);色譜柱為Hypersil GOLD C18(250mm×4.6 mm,5μm);電子天平(德國 SARTORIUS公司/BT224S型);超聲波清洗器(ASCIENCE公司/AS3120B型);0.45μm微孔濾膜;蘆丁、槲皮素、金絲桃苷、山柰酚、齊墩果酸、熊果酸、β-谷甾醇(上海源葉科技有限公司);甲醇(色譜純);乙酸(分析純);蒸餾水;市售中藥.

1.2 色譜條件

測定熊果酸、齊墩果酸和β-谷甾醇的含量時,采用水為流動相A,甲醇為流動相B,流速為1.0 mL/min;檢測波長為210 nm,柱溫為室溫;進樣量為5μL.洗脫程序為:0～10 m in,90%B;10～11 min,90%～100%B;11～33 min,100%B;33～35min,100%～90%B;35～50min,90%B.測定蘆丁、槲皮素、金絲桃苷、山柰酚的含量時,采用0.5%的CH3COOH溶液為流動相A,甲醇為流動相B,流速為0.8 m L·min-1;檢測波長為350 nm;柱溫為室溫;進樣量為 5μL.洗脫程序為:0～2 m in,45%B;2～15 m in,45%～60%B;15～20min,60%B;20～30min,60%～100%B;30～40 m in,100%B;40～45 min,100%～45%B;45～50min,45%B.

1.3 溶液的配制

1.3.1 標準品溶液的配制 精密稱取標準品蘆丁、槲皮素、金絲桃苷、山柰酚、熊果酸、齊墩果酸和β-谷甾醇各5 mg,用甲醇溶解制成濃度為0.1 mg/m L的溶液,0.45μm濾膜過濾,即得標準品溶液,備用.

1.3.2 樣品溶液的配制 分別稱取3份干燥的植物樣品約10 g,加入30mL甲醇,超聲提取3次(每次20m in),過濾,收集提取液,合并3次提取液,濃縮干燥得提取物.精密稱取適量提取物,用甲醇溶解,制成10 mg/mL的溶液,0.45μm濾膜過濾,即得樣品溶液,備用.

1.4 精密度實驗

精密吸取濃度為0.1 mg·m L-1的齊墩果酸、熊果酸、β-谷甾醇標準品混合溶液和蘆丁、槲皮素、金絲桃苷、山柰酚標準品混合溶液5μL進樣,連續(xù)進樣4次,測定峰面積.計算得齊墩果酸、熊果酸、β-谷甾醇、蘆丁、槲皮素、金絲桃苷和山柰酚面積的RSD分別為 0.5%、0.3%、0.4%、0.7%、0.5%、0.1%、0.2%,這表明儀器精密度良好.

1.5 樣品含量測定

精密吸取植物樣品甲醇溶液5μL注入高效液相色譜儀中,分別測定蘆丁、槲皮素、金絲桃苷、山柰酚、熊果酸、齊墩果酸和β-谷甾醇的色譜峰峰面積,按照公式(1)計算植物樣品中蘆丁等常規(guī)成分的含量.

1.6 樣品活性掃描

1.6.1 自由基清除實驗 將干燥的植物樣品提取物配制成1 mg/m L的甲醇溶液,向微孔板中移取160μL樣品和 40μL DPPH(1.5×10-4mol/L),平行樣品為3個.陽性參照物選用0.1 mL/min維生素C,對照溶液為160μL甲醇和40 μL DPPH混合液,點樣完畢后在室溫下反應(yīng)30 min,用酶標儀在520 nm下測其吸光值.按照公式(2)計算其抑制率.

式中Ac為對照溶液吸光度,As為樣品溶液吸光度,Ab為空白溶液吸光度.

1.6.2 酪氨酸酶抑制活性實驗 精密稱取1 m g干燥的植物樣品提取物,溶于50%DMSO溶液中,配制成1mg/m L的樣品溶液.分別移取40μL樣品、40μL 酪氨酸溶液、80μL Na2HPO4-NaH2PO4緩沖溶液及40μL酪氨酸酶溶液于微孔板中,平行樣品為3個.陽性參照物選用0.1 mg/mL曲酸溶液,對照溶液為40μL 50%DMSO溶液、40μL 酪氨酸溶液、80μL Na2HPO4-NaH2PO4緩沖溶液及40μL酪氨酸酶溶液的混合液.在37℃下反應(yīng)30 min后在475 nm下測其吸光值.抑制率按照公式(2)計算.

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品的提取

本實驗采用常用的有機溶劑提取法.在室溫條件下,分別用甲醇、丙酮、70%丙酮溶液浸泡植物樣品多次,每次超聲提取20 min,濃縮干燥稱重.經(jīng)計算,甲醇的提取率為49.4%,丙酮的提取率為5.0%,70%丙酮溶液的提取率為17.6%,由此可知甲醇為最佳提取溶劑.

2.2 流動相的選擇

本實驗在測定蘆丁、槲皮素、金絲桃苷、山柰酚的含量時,選用甲醇-0.5%CH3COOH溶液體系以及各種不同的梯度洗脫方案,而在測定齊墩果酸、熊果酸、β-谷甾醇的含量時,使用了甲醇-水體系以及各種不同的梯度洗脫方案進行洗脫.結(jié)果顯示,在本實驗所采用的流動相以及梯度洗脫程序條件下(1.2色譜條件),分離效果最佳,樣品的色譜峰達到了基線分離,得到的色譜峰峰形對稱.每次運行梯度后,柱平衡至少需要10 m in[6].

2.3 檢測波長的選擇

經(jīng)HPLC-DAD檢測器檢測,在1.2色譜條件下,在吸收波長200～400 nm區(qū)間進行掃描.從中找出最大吸收波長,并且在此吸收波長下混合標準溶液的色譜峰分離效果最佳,達到了基線分離,由此確定熊果酸、齊墩果酸和β-谷甾醇的檢測波長為210 nm[7],蘆丁、槲皮素、金絲桃苷、山柰酚的檢測波長為350 nm[8].

2.4 植物樣品含量測定結(jié)果

由于本實驗所選用的蘆丁、槲皮素、金絲桃苷、山柰酚、齊墩果酸、熊果酸、β-谷甾醇等7種標準品均是活性較好的化合物,因此本文選用了這7種標準品做為常規(guī)成分含量的分析,測定結(jié)果見表1.

表1 植物樣品中蘆丁、槲皮素、金絲桃苷、山柰酚、齊墩果酸、熊果酸和β-谷甾醇的含量 %

續(xù)表1_________________________________________________________________________

續(xù)表1__________________________________________________________________________

由表1可知,蘆丁的含量在0.02%～1.39%之間的植物樣品有32種,其中肉芙蓉中含量最高;槲皮素的含量在0.01%～0.34%之間的有22種,血見愁中含量最高;金絲桃苷的含量在0.01%～1.11%之間的有47種,千里光中的含量最高;山柰酚的含量在0.01%～0.13%的有19種,血見愁中的含量最高;齊墩果酸的含量在0.08%～3.12%之間的有26種,山楂中的含量最高;熊果酸的含量在0.05%～12.06%之間的有21種,山楂中的含量最高;β-谷甾醇的含量在0.13%～7.13%之間的有28種,蘆根中的含量最高.

2.5 植物樣品活性掃描結(jié)果

對DPPH的清除實驗結(jié)果和對酪氨酸酶的抑制實驗結(jié)果見表2.表2表明:對酪氨酸酶的抑制率在50%以上的植物有30種,在30%～40%的有42種,其中土大黃提取物對酪氨酸酶的抑制率達到99.4%,而百合提取物僅為1.3%;DPPH的抑制率在80%以上的有83種,其中土大黃、尾葉香茶菜、旱蓮草提取物對DPPH的抑制率均達到99.9%,而南沙參提取物僅為34.4%.

表2 藥用植物樣品提取物對DPPH及酪氨酸酶的抑制率 %

續(xù)表2_____________________________________________________________________

3 結(jié)論

本實驗在室溫條件下使用不同的有機溶劑對藥用植物樣品的提取工藝做了試驗研究,通過對比提取率,篩選出甲醇為最佳提取溶劑.通過對流動相體系、流速、最大吸收波長等色譜條件的篩選,建立了簡便、準確、可靠的高效液相色譜-紫外檢測的分析方法,從而準確地測定了長白山地區(qū)常見藥用植物樣品中蘆丁、槲皮素、金絲桃苷、山柰酚、齊墩果酸、熊果酸和β-谷甾醇等常規(guī)成分的含量,這些數(shù)據(jù)將為長白山地區(qū)常見的藥用植物的開發(fā)提供基礎(chǔ)實驗依據(jù).

[1]張繼有,嚴仲鎧,李海日,等.長白山植物藥志[M].長春:吉林人民出版社,1982.

[2]鄒盛勤,陳武.反相高效液相色譜法測定不同產(chǎn)地紫蘇子和白蘇子中烏索酸和齊墩果酸[J].生物加工過程,2008,6(4):65-68.

[3]鄭珺,孫蘭香,王紫秋,等.油菜花粉中槲皮素和山柰素總含量的 HPLC法測定[J].中國新藥雜志,2005,14(5):592-594.

[4]劉之力,涂彩霞,史月君,等.54味中藥乙醇提取物對酪氨酸酶活性抑制作用的研究[J].中國麻風皮膚病雜,2003,19(3):257.

[5]王繼龍,李江楠,趙偉,等.16種長白山野生植物提取物對酪氨酸酶抑制作用[J].中國野生植物資源,2008,27(3):42-44.

[6]靳曉秋,陳黎.HPLC法同時測定野馬追中金絲桃苷、槲皮素和山奈酚[J].中草藥,2008,39(8):1254-1255.

[7]謝瑩,杭太俊,程贊,等.高效液相色譜法測定中藥中齊墩果酸和熊果酸含量[J].中國中藥雜志,2001,26(9):615-616.

[8]鄭一敏,胥秀英,楊艷紅,等.HPLC測定菟絲子中金絲桃苷與槲皮苷的含量[J].華西藥學雜志,2005,20(3):261-262.

The Detection of Component and Activity Scanning from Common Medicinal Plants in Changbai Mountain Area

ZHANG Tao, PIAO Yan, ZHAO Ping, L IXi-feng＊
(KeyLaboratoryofNaturalResourcesoftheChangbaiMountain&FunctionalMolecules(YanbianUniversity),MinistryofEducation,Yanji133002,China)

U sing high perfo rmance liquid Chromatography(HPLC)to determine the content of rutin,quercetin,hyperoside,kaempferol,oleanolic acid,ursolic acid,β-sitosterol of the 100 species which were commonly used in traditional Chinesemedicine in Changbaimountain area.The DPPH radical scavenging activity and tyrosinase inhibito ry activity of extracts of these medicinal p lants were scanned.The inhibition rate of 83 kinds medicinal plants against DPPH radical are mo re than 80%,and 30 kindsmedicinal p lants against tyrosinase is above 50%.Experiments sho wthat the simple,fast,accurate and reliablemethod isestablished,and the basis experimental evidence is p rovided for the development of medicinal p lants in Changbaimountain area.

general components;Changbaimountain area;high performance liquid chromatography;content test;activity scanning

R284.1

A

1004-4353(2011)02-0165-06

2011-05-21

＊通信作者:李熙峰(1969—),男,博士,教授,研究方向為天然物化學.