楊翠, 何苗, 張美花

(長(zhǎng)白山生物資源與功能分子教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 (延邊大學(xué)),吉林延吉133002)

利用氣流吹掃微注射器萃取技術(shù)分析植物釋放揮發(fā)性物質(zhì)的晝夜節(jié)律

楊翠, 何苗, 張美花

(長(zhǎng)白山生物資源與功能分子教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 (延邊大學(xué)),吉林延吉133002)

利用氣流吹掃微注射器萃取技術(shù)和氣相色譜-質(zhì)譜對(duì)植物(碰碰香)釋放的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè),分析其晝夜節(jié)律變化.實(shí)驗(yàn)定性了22種揮發(fā)性物質(zhì),其中單萜類化合物種類最多(9種);大多數(shù)揮發(fā)性物質(zhì)在07:00～17:00之間達(dá)到釋放高峰,少數(shù)物質(zhì)在21:00至次日05:00達(dá)到釋放高峰;不同類揮發(fā)性物質(zhì)釋放量的變化情況存在差異性.實(shí)驗(yàn)表明:氣流吹掃微注射器萃取技術(shù)實(shí)現(xiàn)了自然狀態(tài)下對(duì)植物釋放的揮發(fā)性物質(zhì)的監(jiān)測(cè),是一種新型的、非破壞性的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)植物釋放揮發(fā)性物質(zhì)的技術(shù).

氣流吹掃微注射器萃取;碰碰香;揮發(fā)性物質(zhì);晝夜節(jié)律;氣相色譜-質(zhì)譜;實(shí)時(shí)分析

0 引言

植物是環(huán)境中揮發(fā)性氣體的主要來(lái)源之一.絕大多數(shù)植物都是通過(guò)葉片氣孔向大氣中釋放各種揮發(fā)性物質(zhì)[1],這些揮發(fā)性物質(zhì)可以作為植物間以及植物和昆蟲之間傳遞行為信息的化學(xué)信號(hào)[2-5],而且對(duì)其周圍的環(huán)境產(chǎn)生一定影響[6],因此,對(duì)植物釋放的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行實(shí)時(shí)分析監(jiān)測(cè)具有重要意義.

常用來(lái)提取植物中揮發(fā)性物質(zhì)的方法有溶劑萃取法、水蒸氣蒸餾法[7]等,但這些方法都無(wú)法在自然狀態(tài)下對(duì)揮發(fā)物進(jìn)行采集,不能反映當(dāng)時(shí)植物中揮發(fā)性物質(zhì)的真實(shí)情況.近年來(lái),隨著揮發(fā)性物質(zhì)采集技術(shù)的不斷完善,出現(xiàn)了直接采集法和間接采集法.直接采集法是指直接采集氣體樣品進(jìn)行分析檢測(cè).常用的采集容器有不銹鋼罐、注射管、采樣袋等.間接采集法是指將氣體中的待測(cè)揮發(fā)性有機(jī)物吸附在另一載體中,再通過(guò)解吸過(guò)程對(duì)待測(cè)物進(jìn)行分析檢測(cè).按解吸的途徑不同,間接采集法主要分為吸附-溶劑洗脫法、吸附-熱脫附法和固相微萃取法.這些方法雖然可以檢測(cè)活體植物的揮發(fā)性物質(zhì),但是也存在一些缺點(diǎn),例如:直接采集法受外界因素干擾很大,靈敏度低;間接采樣法需對(duì)吸附材料、解析溶劑和解析溫度進(jìn)行選擇,而且很難實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)分析(吸附過(guò)程一般需要較長(zhǎng)的時(shí)間);固相微萃取法回收率和精密度不高,且固相微萃取纖維頭昂貴、易碎、使用壽命短[8-9].更重要的是這些方法很難在自然狀態(tài)下對(duì)植物釋放揮發(fā)成分的原有信息進(jìn)行檢測(cè)分析.

氣流吹掃微注射器萃取技術(shù)(GP-MSE)是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種新型樣品前處理技術(shù).該技術(shù)是基于液相微萃取[10]和氣流式頂空液相微萃取技術(shù)而開(kāi)發(fā)的[11],具有快速、經(jīng)濟(jì)、環(huán)境友好、萃取效率高等優(yōu)點(diǎn),已成功應(yīng)用于環(huán)境樣品和植物樣品中揮發(fā)性和半揮發(fā)性物質(zhì)(有毒有機(jī)污染物和揮發(fā)油)的檢測(cè)中.本文利用氣流吹掃微注射器萃取與氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)聯(lián)用技術(shù)實(shí)時(shí)檢測(cè)植物(碰碰香)釋放的揮發(fā)性物質(zhì),通過(guò)分析揮發(fā)性物質(zhì)的化學(xué)成分及含量來(lái)探討植物釋放揮發(fā)性物質(zhì)的晝夜節(jié)律.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與溶劑

儀器有:GC-MS 2010(日本島津公司),250 m L微型注射器(美國(guó) HAMIL TON公司),AS20500A H型超聲波清洗器(天津 AU-TOSCIENCE公司),進(jìn)樣墊(日本島津公司),聚四氟乙烯管,溫度計(jì).試劑有:正己烷,二氯甲烷,甲醇,均為色譜純.

1.2 實(shí)驗(yàn)過(guò)程

樣品采集:將植物樣品放置在密封的容器中,從底部注入已凈化的空氣(氣體流速為 2 mL/min),使用注射器在頂部進(jìn)行樣品采集(圖1).采集時(shí)間為2011年4月14日至15日,每隔2 h采集一次樣品,每個(gè)樣品采集時(shí)間為10 min,共采集12個(gè)樣品.具體時(shí)間為:09:00,11:00,13:00,15:00,17:00,19:00,21:00,23:00,次日 01:00,03:00,05:00,07:00.

將植物放入密閉的容器中,非采樣時(shí)間取下容器上、下端的進(jìn)樣墊,采樣時(shí)如圖1安裝.從左下端通入凈化的空氣(流速為2m L/m in),在容器右上端的250μL微注射器(依次用甲醇、二氯甲烷、正己烷洗滌[12])內(nèi)加入20μL正己烷作為萃取溶劑萃取.萃取10min后,用正己烷定容至100 μL,取2μL進(jìn) GC-MS分析.整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程在室溫下進(jìn)行.

圖1 揮發(fā)性氣體采集裝置(1為注射器;2為進(jìn)樣墊;3為溫度計(jì))

1.3 GC-MS分析條件

GsBP-5 MS毛細(xì)石英柱(30 mm×0.25 mm×0.25μm),載氣為氦 (純度 ≥99.99%),進(jìn)樣口溫度為280℃,進(jìn)樣量為2μL,采用不分流模式進(jìn)樣.載氣(He)流速為0.98 m L/min,升溫程序?yàn)?初始溫度 45℃,6℃/min升至 250℃,10℃/min升至280℃,保持5 min.離子源為 EI,溫度為200℃,電子能量為70 Ev.

2 結(jié)果與討論

2.1 植物釋放揮發(fā)性物質(zhì)晝夜節(jié)律分析

通過(guò)對(duì)植物釋放的揮發(fā)性氣體進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè),并對(duì)各個(gè)色譜峰通過(guò)N ISI 08質(zhì)譜庫(kù)檢索、定性,共鑒定出22種揮發(fā)性物質(zhì).表1為22種揮發(fā)性物質(zhì)在24 h內(nèi)各采樣時(shí)間點(diǎn)的組分及含量表.從表1可知,植物釋放的揮發(fā)性物質(zhì)主要化學(xué)成分是萜類化合物和脂肪族化合物,其中單萜類化合物種類最多(9種)[13].絕大多數(shù)揮發(fā)性物質(zhì)在14日07:00～17:00之間達(dá)到釋放高峰,17:00之后釋放量突然降低,有些甚至未檢測(cè)到,這可能是由于白天和晚上溫差大,溫度突然降低導(dǎo)致葉片氣孔不同程度關(guān)閉的結(jié)果.也有少數(shù)揮發(fā)性物質(zhì)在21:00到次日5:00之間達(dá)到釋放高峰,如安息香醛(Benzaldehyde),1-羥基環(huán)己基苯基丙酮(1-Hydroxycyclohexyl phenyl ketone),鄰苯二甲酸二異丁酯(Diisobutyl phthalate),丙酸異龍腦酯(Isop ropyl Palm itate),這是由于揮發(fā)性物質(zhì)的釋放不僅與外界環(huán)境因素有關(guān)[14],還與合成這種物質(zhì)的底物和酶及其代謝過(guò)程有關(guān)[15].

表1 24 h內(nèi)碰碰香釋放的揮發(fā)性物質(zhì)的化學(xué)組分及其含量

圖2中列舉了22種揮發(fā)性物質(zhì)中比較有代表性的成分.在圖2A中:α-蒎烯(alpha.-Pinene),崁烯(Camphene)和α-松油烯(alpha.-Terpinene)均在17:00達(dá)到釋放高峰;1,7,7-三甲基-二環(huán)[2.2.1]庚-2-乙酸酯(Acetic acid,1,7,7-trimethyl-bicyclo[2.2.1]hep t-2-yl ester),丙烯酸異冰片酯(Isobo rnyl acrylate)和丙酸異龍腦酯(Isobornyl p ropionate)均在15:00達(dá)到釋放高峰.其中α-松油烯在24 h內(nèi)的各時(shí)間段變化速率明顯不同,并且在13:00至15:00釋放速率較快,而丙烯酸異冰片酯(Isobornyl acrylate)釋放高峰出現(xiàn)在13:00,并在13:00至17:00釋放速率較快.從圖2B可知,部分揮發(fā)性物質(zhì)的晝夜時(shí)內(nèi)釋放雖然遵循晝夜節(jié)律,但沒(méi)有明顯的規(guī)律性變化,如烯丙基戊酸(A llyl pentanoate).從以上觀察可以得出,絕大多數(shù)揮發(fā)性物質(zhì)白天的釋放量比晚上多,不同化合物在同一時(shí)間段的釋放速率不同,同一物質(zhì)在不同時(shí)期的釋放速率也存在差異.

圖2 植物碰碰香釋放揮發(fā)性物質(zhì)的晝夜節(jié)律

2.3 植物碰碰香釋放揮發(fā)性物質(zhì)的分類分析

根據(jù)揮發(fā)性物質(zhì)結(jié)構(gòu)中所帶官能團(tuán)不同植物釋放的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行分類分析得到圖3.從圖3中可知,植物碰碰香各類揮發(fā)性物質(zhì)的釋放高峰均在13:00～17:00之間,且白天的釋放量高于晚上.其中單萜類化合物和芳香族類化合物的釋放量隨時(shí)間的變化幅度較大,而脂肪族類化合物和氧化單萜類化合物的釋放量隨時(shí)間的變化相對(duì)比較平緩.這些現(xiàn)象產(chǎn)生不僅與植物體和化合物本身性質(zhì)有關(guān),還與外界環(huán)境條件有著密切關(guān)系.

3 植物碰碰香釋放的揮發(fā)性物質(zhì)的分類分析

3 結(jié)論

本文利用氣流吹掃微注射器萃取技術(shù)和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用研究碰碰香植物中揮發(fā)性物質(zhì)釋放的晝夜節(jié)律.共鑒定出22種揮發(fā)性化合物,并進(jìn)行了分類分析,其中單萜類化合物種類最多(9種).植物揮發(fā)性物質(zhì)的釋放量遵循晝夜節(jié)律,其中大多數(shù)揮發(fā)性物質(zhì)的釋放高峰出現(xiàn)在白天,少數(shù)化合物釋放高峰出現(xiàn)在晚上,但不是所有揮發(fā)性物質(zhì)都存在明顯的變化規(guī)律(如烯丙基戊酸);單萜類化合物和芳香族化合物釋放量晝夜變化幅度相對(duì)較大,而氧化單萜類和脂肪族類化合物釋放量變化相對(duì)比較平緩.

本研究方法操作簡(jiǎn)單,萃取溶劑用量少,萃取時(shí)間短,萃取率高,實(shí)現(xiàn)了在自然狀態(tài)下監(jiān)測(cè)植物釋放的揮發(fā)性物質(zhì),是一種新型的揮發(fā)性物質(zhì)實(shí)時(shí)檢測(cè)技術(shù),可以廣泛應(yīng)用于植物的成分分析及信息傳導(dǎo)相關(guān)的研究領(lǐng)域中.

[1]李繼泉,金幼菊,沈應(yīng)柏,等.環(huán)境因子對(duì)植物釋放揮發(fā)性化合物的影響[J].植物學(xué)通報(bào),2001,18(6):649-656.

[2]A rimura G,Ozawa R,Hoiuchi J,et al.Plant-p lant Interactions Mediated by Volatiles Emitted from Plants Infested by Spider Mites[J].Biochem Syst Ecol,2001,29(10):1049-1061.

[3]Bald win IT,Halitschke R,Paschold A,et al.Volatile Signaling in Plant-p lant Interactions:Talking Trees in the Genomics Era[J].Science,2006,311(5762):812-815.

[4]Runyon J B,Mescher MC,CMde Mo raes.Volatile Chemical Cues Guide Host Location and Host Selection by Parasitic Plants[J].Science,2006,313(5795):1964-1967.

[5]杜家緯.植物-昆蟲間的化學(xué)通訊及其行為控制[J].植物生理學(xué)報(bào),2001,27(3):193-200.

[6]鄧曉軍,陳曉亞,杜家緯.植物揮發(fā)性物質(zhì)及其代謝過(guò)程[J].植物生理與分子生物學(xué)學(xué)報(bào),2004,30(1):11-18.

[7]Jalali,Heravi M,Sereshti H.Determination of Essential Oil Components of A rtemisia Haussknechtii Boiss.Using Simultaneous Hydrodistillation-static Headspace Liquidphase Microextraction-gas Chromatography Mass Spectrometry[J].J Chromatogr A,2007,1160(1):81-89.

[8]Ye Cunling,Zhou Qingxiang,Wang Xinming.Headspace Liquid-phase Microextraction Using Ionic Liquid as Extractant fo r the Preconcentration of Dichlorodiphenyltrichloroethane and Its Metabolites at Trace Levels in Water Samples[J].Anal Chim Acta,2006,572(2):165-171.

[9]A li S Y,Amirhassan A.Liquid-phase microextraction[J].Trends Anal Chem,2010,29(1):1-14.

[10]Yang Cui,Piao Xiangfan,Qiu Jinxue,et al.Gas Purge Microsyringe Extraction fo r Quantitative Direct Gas Chromatographic-mass Spectrometric A-nalysisof Volatile and Semivolatile Chemicals[J].J Chromatogr A,2011,1218(12):1549-1555.

[11]Yang Cui,Qiu Jinxue,Ren Chunyan,et al.Gas Fo wHeadspace Liquid Phase Microextraction[J].J Chromatogr A,2009,1216(45):7694-7699.

[12]李東浩,閻雪.一種洗色譜進(jìn)樣針的裝置:中國(guó),200820071370.4[P].2008-12-03.

[13]Niinement,Reichstein M,Staudt M,et al.Stom tal Constraints May Affect Emission of Oxygenated Mono terpenoids f rom the Foliage of Pinus Pinea[J].Plant Physiol,2002,130(3):1371-1385.

[14]胡永建,任琴,金幼菊,等.馬尾松(Pinusmassoniana)、濕地松(Pinuselliotii)揮發(fā)性化學(xué)物質(zhì)的晝夜節(jié)律釋放[J].生 態(tài) 學(xué) 報(bào),2007,27(2):565-570.

[15]Dudareva N,Pochersky.Biochemistry and Molecular Genetic A spects of Flo ral Scent[J].Plant Physiol,2000,122(3):627-634.

Diurnal Cycle Rhythm Change of Em ission of Volatile Compounds from Plant was Analysised by Using Gas Purge Microsyringe Extraction

YANG Cui, HEMiao, ZHANGMei-hua
(KeyLaboratoryofNaturalResourceoftheChangbaiMountainandFunctionalMolecules(YanbianUniversity),MinistryofEducation,Yanji133002,China)

Gas purge microsyringe extraction(GP-MSE)and gas chromatographic-mass spectrometric were used for real-timemonito ring of emission of volatile compounds from p lant(Plectranthustomentosa),and analyzed the changeof diurnal cycle rhythm.In this study,22 compoundswere identified and monoterpene hydrocarbons(9 compounds)were the most in these volatile compounds.The most of these volatile compounds achieved the high peak of emission were between 07:00-17:00.A small number of substances reached the high peak were between 21:00 to 5:00 the next day.The differences of change of different type compounds were also exist.The results sho wthat the GP-MSE achieve the real timemonito ring of volatile compounds from p lants under natural conditions,it is a novel,non-estrutive real time monitoring technology of volatile compounds.

gas purgemicrosyringe extraction(GP-MSE);Plectranthustomentosa;volatile compounds;diurnal cycle rhythm;GC-MS;real-time analysis

O658.2

A

1004-4353(2011)02-0119-05

2011-0 3-21

楊翠(1984—),女,博士研究生,研究方向?yàn)橛袡C(jī)分析.