姚蔚，謝旦立，郭雅君，樓永良

（溫州醫(yī)學(xué)院 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院，浙江 溫州 325035）

創(chuàng)傷弧菌溶細(xì)胞素融合蛋白誘導(dǎo)人Jurkat-T淋巴細(xì)胞凋亡的研究

姚蔚，謝旦立，郭雅君，樓永良

（溫州醫(yī)學(xué)院 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院，浙江 溫州 325035）

目的：探討創(chuàng)傷弧菌溶細(xì)胞素融合蛋白（rVvhA）對人Jurkat T淋巴細(xì)胞凋亡的作用及凋亡過程中Caspase-3酶活性的變化。方法：利用基因工程方法體外表達(dá)、制備和純化rVvhA；MTT法檢測rVvhA對Jurkat T淋巴細(xì)胞的細(xì)胞毒活性影響；Annexin-V/PI雙染流式細(xì)胞儀檢測rVvhA誘導(dǎo)Jurkat T淋巴細(xì)胞凋亡情況；Hochest33258熒光染色激光共聚焦顯微鏡觀察rVvhA誘導(dǎo)Jurkat T細(xì)胞核形態(tài)的改變；分光光度法檢測凋亡過程中Caspase-3酶活性的變化。結(jié)果：純化復(fù)性后rVvhA的純度達(dá)到92%以上；MTT結(jié)果顯示rVvhA活性蛋白能顯著抑制Jurkat T淋巴細(xì)胞的生長，有效濃度為1.5 HU/mL；流式細(xì)胞儀和激光共聚焦檢測發(fā)現(xiàn)rVvhA作用后Jurkat T淋巴細(xì)胞核固縮，產(chǎn)生亮藍(lán)熒光，1.5 HU/mL rVvhA，作用4 h后即可有效誘導(dǎo)其凋亡，凋亡率為（39.13±3.33）%，對照組為（3.43±0.34）%，且能被Caspase全酶抑制劑一定程度抑制。1.5 HU/mL rVvhA作用Jurkat T淋巴細(xì)胞3 h，Caspase-3酶活性達(dá)到高峰。結(jié)論：rVvhA能損傷人Jurkat T淋巴細(xì)胞，誘導(dǎo)其發(fā)生細(xì)胞凋亡，Caspase-3可能在rVvhA誘導(dǎo)的Jurkat T細(xì)胞凋亡過程中起重要作用。

創(chuàng)傷弧菌溶細(xì)胞素；人Jurkat T淋巴細(xì)胞；細(xì)胞凋亡

創(chuàng)傷弧菌是一種革蘭染色陰性的嗜鹽性條件致病菌，對人類危害較大，感染后致死率達(dá)75%[1]。肝病患者等免疫功能低下的人群是其感染致病的主要高危人群。創(chuàng)傷弧菌感染后，短時間內(nèi)就會引起傷口炎癥，嚴(yán)重時會導(dǎo)致敗血癥的發(fā)生。在該菌諸多的毒力因子中，創(chuàng)傷弧菌溶細(xì)胞素作為唯一分泌至胞外具有該菌種屬特異性的外毒素，是創(chuàng)傷弧菌感染的重要毒力因子之一。我們前期工作已證實(shí)了創(chuàng)傷弧菌溶細(xì)胞素融合蛋白rVvhA能誘導(dǎo)人ECV-304細(xì)胞凋亡和SMMC7721人肝癌細(xì)胞TNF-α、HSP90等炎癥因子基因的表達(dá)[1]。T淋巴細(xì)胞作為機(jī)體免疫系統(tǒng)的重要組成部分，對機(jī)體免疫系統(tǒng)的平衡、監(jiān)控及抵御外界感染具有重要作用。綜合國內(nèi)外研究，本實(shí)驗(yàn)以人Jurkat T淋巴細(xì)胞為模型，通過研究創(chuàng)傷弧菌溶細(xì)胞素融合蛋白rVvhA對T細(xì)胞損傷的影響，對于了解創(chuàng)傷弧菌溶細(xì)胞素與T淋巴細(xì)胞間的作用、創(chuàng)傷弧菌感染時對T淋巴系統(tǒng)的影響以及創(chuàng)傷弧菌感染敗血癥的致病機(jī)制都具有積極意義。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒、菌株與紅細(xì)胞：大腸桿菌（E.coli）表達(dá)菌BL21（DE3）、重組表達(dá)載體pET28a（+）-vvhA由課題組保存及構(gòu)建，人急性淋巴性白血病Jurkat T淋巴細(xì)胞株由浙江省醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。1.1.2 主要試劑與試劑盒：Ni2+-NTA親和層析柱購自上海申能生物科技有限公司；異丙基硫代β-D-半乳糖苷（IPTG）購自寶生物工程（大連）有限公司；還原型谷胱甘肽（GSH）、氧化型谷胱甘肽（GSSH）、鹽酸胍均購自BBI公司；RPMI1640液體培養(yǎng)基購于美國Hyclone公司；細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、Caspase全酶抑制劑（Z-VAD-FMK）、MTT細(xì)胞毒性與增殖檢測試劑盒均購于碧云天生物技術(shù)研究所；羊抗鼠多克隆抗體購于北京天根生物技術(shù)有限公司。膜聯(lián)蛋白（Annexin）V-488/PI凋亡檢測試劑盒、Caspase-3分光光度法檢測試劑盒均購于南京凱基生物技術(shù)有限公司。優(yōu)級胎牛血清購于杭州四季青生物工程材料有限公司。

1.2 方法

1.2.1 創(chuàng)傷弧菌溶細(xì)胞素融合蛋白的表達(dá)、純化、復(fù)性及鑒定：參照文獻(xiàn)[7]進(jìn)行，終濃度為0.5 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)E.coliBL21（DE3）表達(dá)rVvhA，超聲破碎菌體分離粗提包涵體，經(jīng)三步洗滌，Ni2+-NTA親和層析柱梯度洗脫純化。純化后用復(fù)性液[55 mmol/L Tris-HCl（pH 6.0）、10.56 mmol/L NaCl、550 mmol/L精氨酸、0.44 mmol/L KCl、550 mmol/L鹽酸胍、1.1 mmol/L EDTA（pH 8.0）、440 mmol/L蔗糖、GSH:GSSH=10:1]結(jié)合分步透析法對rVvhA進(jìn)行復(fù)性。

1.2.2 人Jurkat T淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)傳代：Jurkat T淋巴細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%青/鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液中，置于37 ℃、5% CO2飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3 d換液傳代。

1.2.3 MTT法測定Jurkat T細(xì)胞的增殖抑制率：選擇對數(shù)生長期Jurkat T淋巴細(xì)胞，接種于96孔培養(yǎng)板，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104/mL，每孔100μL，分別加入終濃度為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 HU/mL的rVvhA活性蛋白，以未加rVvhA處理的細(xì)胞為對照組，置37 ℃、5% CO2條件培養(yǎng)4 h。加入10 mL MTT（5 mg/mL），37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，將96孔板11000 r/min離心5 min，小心吸棄培養(yǎng)液上清，每孔加入100 mL DMSO溶解formazon。檢測各孔570 nm吸光度值（每一組設(shè)3個重復(fù)孔），以表示細(xì)胞的存活情況。

1.2.4 Annexin-V/PI雙染檢測細(xì)胞凋亡：無血無抗RPMI1640預(yù)處理Jurkat T淋巴細(xì)胞24 h。進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分組，分別為培養(yǎng)液對照組、0.5 HU/mL rVvhA處理組、1.0 HU/mL rVvhA處理組、1.5 HU/mLrVvhA處理組、1.5 HU/mL+20μL Z-VAD-FMK處理組（ZVAD-FMK預(yù)處理Jurkat T淋巴細(xì)胞1 h），作用4 h后，收集不同處理組細(xì)胞。用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，將細(xì)胞重懸于Binding Buffer中，依次加入5 mL 膜聯(lián)蛋白（Annexin）V-488及5 mL PI，混勻，室溫避光反應(yīng)15 min，1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡率。

1.2.5 Hochest33258熒光染色觀察細(xì)胞核形態(tài)：Jurkat T淋巴細(xì)胞先用無血無抗RPMI1640預(yù)處理培養(yǎng)24 h。將細(xì)胞分為對照組、1.5 HU/mL rVvhA組、Caspase全酶抑制劑預(yù)處理組。作用4 h后，收集不同處理組細(xì)胞，PBS洗滌，按Hochest33258細(xì)胞凋亡檢測試劑盒操作說明進(jìn)行細(xì)胞熒光染色。染色結(jié)束后，用PBS洗滌細(xì)胞，小心涂片，并用抗熒光猝滅封片液封片，使用激光共聚焦顯微鏡（×200）觀察細(xì)胞凋亡的細(xì)胞核形態(tài)。

1.2.6 分光光度法檢測Caspase-3活性變化：收集時間點(diǎn)為0、1、2、3、4 h對照組與濃度為1.5 HU/mL rVvhA處理組的Jurkat T淋巴細(xì)胞，PBS洗滌細(xì)胞2次，將細(xì)胞密度調(diào)整為5×106個/組。在收集的沉淀細(xì)胞中加入50 mL冰冷Lysis Buffer（使用前每50 mL Lysis Buffer加入0.5 mL DTT），吹打均勻。按照Caspase-3檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作。處理后的樣品加樣于96孔板，酶標(biāo)儀檢測λ=405 nm時的吸光值（OD）。通過計(jì)算ODrVvhA處理組/OD陰性對照來確定凋亡誘導(dǎo)劑組Caspase-3活化程度。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。多組間比較采用單因素方差分析，組內(nèi)兩兩比較采用LSD方法。

2 結(jié)果

2.1 rVvhA包涵體的復(fù)性 純化后的rVvhA包涵體經(jīng)復(fù)性液復(fù)性結(jié)合透析復(fù)性后，復(fù)性率可達(dá)18%，復(fù)性后蛋白的分子量約為54 kDa。BandScan V5.0軟件分析后，復(fù)性后經(jīng)丙酮濃縮，蛋白的純度達(dá)92%以上（見圖1）。

圖1 復(fù)性后rVvhA SDS-PAGE分析圖

2.2 Jurkat T細(xì)胞存活率結(jié)果 人Jurkat T淋巴細(xì)胞經(jīng)不同濃度rVvhA活性蛋白作用4 h后，利用MTT法檢測吸光度值（見圖2），細(xì)胞的存活率以蛋白作用組細(xì)胞和對照組細(xì)胞吸光度平均值的比值來表示。從圖2可知，不同濃度的rVvhA活性蛋白作用Jurkat T細(xì)胞后，與對照組相比，0.5 HU/mL rVvhA作用組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），1、1.5、2、2.5 HU/mL組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。Jurkat T細(xì)胞被2.0 HU/mL rVvhA作用后，細(xì)胞的存活率小于50%。

圖2 rVvhA活性蛋白對Jurkat T淋巴細(xì)胞存活率的影響

2.3 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率 Annexin-V和PI雙染后，通過流式細(xì)胞儀檢測不同濃度rVvhA作用4 h后細(xì)胞凋亡的情況（見圖3-4）。從圖3-4可知，0.5 HU/mL rVvhA作用組與對照組比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。1、1.5 HU/mL rVvhA處理后，凋亡率分別為（21.60±2.17）%、（39.13±3.33）%，且呈劑量依賴性。20μmol/L Z-VAD-FMK預(yù)處理細(xì)胞后，細(xì)胞凋亡率與1.5 HU/mL rVvhA處理組相比，明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

圖3 不同濃度rVvhA作用Jurkat T淋巴細(xì)胞經(jīng)膜聯(lián)蛋白V-488和PI雙染后流式凋亡檢測結(jié)果

圖4 不同濃度rVvhA作用Jurkat T淋巴細(xì)胞流式檢測凋亡分析圖

2.4 rVvhA對Jurkat T細(xì)胞核形態(tài)的影響 Hochest33258熒光染色后（見圖5），正常細(xì)胞核呈彌散均勻的藍(lán)色熒光，呈圓形，染色質(zhì)分布均勻。1.5 HU/mL rVvhA處理組出現(xiàn)細(xì)胞核致密固縮，破裂塊狀，發(fā)亮藍(lán)（或發(fā)白）熒光染色等凋亡核形態(tài)變化。Caspase全酶抑制劑預(yù)處理組中，其亮藍(lán)熒光細(xì)胞數(shù)目有所下降。Caspase全酶抑制劑對rVvhA誘導(dǎo)Jurkat T淋巴細(xì)胞凋亡具有一定的抑制作用。

圖5 rVvhA作用Jurkat T淋巴細(xì)胞4 h后Hochest33258染色結(jié)果（×200）

2.5 rVvhA誘導(dǎo)Jurkat T淋巴細(xì)胞凋亡過程中Caspase-3活性變化 圖6所示，經(jīng)1.5 HU/mL rVvhA處理Jurkat T淋巴細(xì)胞1 h后，Caspase-3活性相比對照組逐漸開始升高。在作用時間4 h內(nèi)，Caspase-3活性于3 h時達(dá)高峰，與對照組比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

圖6 不同時間rVvhA對Jurkat T細(xì)胞Caspase-3酶活性的影響

3 討論

創(chuàng)傷弧菌溶細(xì)胞素已被證實(shí)對多種哺乳動物細(xì)胞具有細(xì)胞毒作用，如血管內(nèi)皮細(xì)胞、紅細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等。前期的工作，我們已證實(shí)體外表達(dá)的rVvhA溶血活性為0.2μg/HU[1]。創(chuàng)傷弧菌感染能引起嚴(yán)重的原發(fā)性敗血癥，到目前為止，該溶細(xì)胞素對淋巴細(xì)胞損傷及損傷機(jī)制目前尚未明確。Kim等[5]以Jurkat T淋巴細(xì)胞株為例，證實(shí)創(chuàng)傷弧菌能通過ROS升高和激活MAPK信號通路殺傷人Jurkat T淋巴細(xì)胞，但并未涉及具體創(chuàng)傷弧菌哪些致病因子與其殺傷Jurkat T淋巴細(xì)胞有關(guān)。本課題組已證實(shí)體外重組的創(chuàng)傷弧菌溶細(xì)胞素亦能引起人ECV304細(xì)胞發(fā)生凋亡[2]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)體外重組的創(chuàng)傷弧菌溶細(xì)胞素rVvhA對人Jurkat T淋巴細(xì)胞有明顯的細(xì)胞毒性，可抑制其生長；4 h的中效濃度（effective concentration for 50%inhibition，EC50）為1.5 HU/mL，低于此濃度時生長抑制不明顯，而高于該濃度時，細(xì)胞生長受到顯著抑制。因此，我們選用此濃度作用人Jurkat T淋巴細(xì)胞。在本實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)1.5 HU/mL rVvhA處理人Jurkat T淋巴細(xì)胞4 h后，經(jīng)Hoechst33258熒光染色可觀察到明顯的細(xì)胞凋亡的核形態(tài)學(xué)改變（核固縮、染色質(zhì)聚集、邊緣化等），流式細(xì)胞儀檢測其誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率為（37.10±0.70）%，說明1.5 HU/mL rVvhA作用濃度較合適誘導(dǎo)人Jurkat T淋巴細(xì)胞凋亡。Caspase全酶抑制劑能一定程度抑制由rVvhA誘導(dǎo)的Jurkat T淋巴細(xì)胞凋亡，rVvhA誘導(dǎo)的Jurkat T細(xì)胞凋亡可能亦于Caspase家族有關(guān)。因此，我們推測，創(chuàng)傷弧菌溶細(xì)胞素可能是創(chuàng)傷弧菌殺傷T淋巴細(xì)胞、Jurkat T淋巴細(xì)胞的重要致病因子，可直接參與創(chuàng)傷弧菌對T淋巴細(xì)胞的殺傷。

研究表明多種基因參與細(xì)胞凋亡的調(diào)控，而Caspase蛋白的表達(dá)是各種細(xì)胞凋亡機(jī)制的最后共同通路。在細(xì)胞凋亡的信號傳遞中，Caspase家族居于重要地位， 激活的Caspase可以水解包括細(xì)胞調(diào)節(jié)、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、DNA修復(fù)等環(huán)節(jié)中重要的蛋白， 從而使細(xì)胞表現(xiàn)為凋亡特有的形態(tài)學(xué)及生化特征：細(xì)胞皺縮、斷裂，染色質(zhì)聚集，DNA降解等。Caspase處于凋亡誘導(dǎo)信號傳遞、Caspase級聯(lián)反應(yīng)、下游效應(yīng)因子作用這一凋亡過程中的中心位置。目前認(rèn)為，在Caspase家族中，Caspase-1、Caspase-11和Caspase-4被認(rèn)為不直接參與凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，它們主要參與白介素前體的活化；而Caspase-2，Caspase-8，Caspase-9和Caspase-10參與細(xì)胞凋亡的起始；參與執(zhí)行的是Caspase-3，Caspase-6和Caspase-7。故我們利用分光光度法檢測rVvhA誘導(dǎo)的Jurkat T淋巴細(xì)胞凋亡中Caspase-3的活化情況，以進(jìn)一步明確和了解創(chuàng)傷弧菌溶細(xì)胞素對人Jurkat T淋巴細(xì)胞凋亡的影響。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)1.5 HU/mL rVvhA作用Jurkat T細(xì)胞3 h后，Caspase-3活性達(dá)到峰值。

本實(shí)驗(yàn)證實(shí)并發(fā)現(xiàn)，創(chuàng)傷弧菌溶細(xì)胞素能直接殺傷Jurkat T淋巴細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)中利用1.5 HU/mL rvvhA 3～4 h，既能引起Jurkat T細(xì)胞發(fā)生明顯的凋亡反應(yīng)，Caspase-3的酶活性達(dá)到峰值，其殺傷效果與殺傷HUVEC及ECV304相比，對淋巴細(xì)胞顯得更為敏感。因此，我們推斷溶細(xì)胞素對靶細(xì)胞的殺傷可能存在組織細(xì)胞特異性，可能與其致病時菌株攻擊的靶器官或臨床癥狀相關(guān)。而淋巴細(xì)胞亦可能是創(chuàng)傷弧菌攻擊的重要靶細(xì)胞。此外，無論在血管內(nèi)皮細(xì)胞還是淋巴細(xì)胞中，我們發(fā)現(xiàn)溶細(xì)胞素引起的靶細(xì)胞凋亡涉及內(nèi)源性和死亡受體介導(dǎo)的凋亡通路，但由于Jurkat T細(xì)胞是天然PTEN缺陷型細(xì)胞株，PTEN能直接作用PI3K信號通路，其缺失可能引起AKT磷酸化的增加，AKT是細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中極為重要的信號分子，與細(xì)胞的增殖等有密切的關(guān)系。因此，Jurkat T淋巴細(xì)胞對溶細(xì)胞素相比ECV304更為敏感是否意味著可能與PTEN涉及的AKT、PI3K、mTOR信號通路有關(guān)。若構(gòu)建PTEN表達(dá)載體轉(zhuǎn)染Jurkat T細(xì)胞后是否能降低溶細(xì)胞素對其的損傷，值得我們思考。綜上，我們推測，創(chuàng)傷弧菌溶細(xì)胞素可能是創(chuàng)傷弧菌殺傷T淋巴細(xì)胞，Jurkat T淋巴細(xì)胞重要致病因子，可直接參與創(chuàng)傷弧菌對T淋巴細(xì)胞的殺傷，但其對細(xì)胞的損傷是否涉及Caspase家族有關(guān)凋亡通路，溶細(xì)胞素對T淋巴細(xì)胞影響的具體分子機(jī)制，還有待深入了解。因此，本實(shí)驗(yàn)為明確創(chuàng)傷弧菌溶細(xì)胞素對免疫細(xì)胞的殺傷作用，為進(jìn)一步了解及完善創(chuàng)傷弧菌的致病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

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Study on the apoptosis of human Jurkat T-lymphocytes induced by recombinant Vibrio vulnificus cytolysin

YAO Wei，XIE Danli，GUO Yajun，LOU Yongliang.
School of Life Science，

School of Laboratory Medicine，Wenzhou Medical College，Wenzhou，325035

Objective:To study the effect of recombinant Vibrio vulnificus cytolysin（rVvhA）on the activity of Caspase-3 and apoptosis in Jurkat T-cells. Method:The growth inhibition of Jurkat T-lymphocytes was measured by MTT assay. The effect of rVvhA on induction of apoptosis of Jurkat T-lymphocytes was studied by Hochest33258 stain and flow cytometry（FCM），respectively. Commercially available colorimetric assay kit was used to measure the activity of caspase-3 based on the spectrophotometric method.Results:Refolded rVvhA was purified with high purity up to 92%；the viability of Jurkat T-cells treated with 1.5 HU/mL rVvhA was inhibited significantly；1.5 HU/mL rVvhA could significantly induce apoptosis on Jurkat T-cells. After treatment with 1.5 HU/mL rVvhA at various times，the activity of Caspase-3 in Jurkat T-cells reached the peak at 3 h.Conclusion:The apoptosis of Jurkat T-cells can be induced by rVvhA， Caspase-3 may play a major role in the apoptosis of rVvhA-exposed cells.

Vibrio vulnificus cytolysin；human Jurkat T-lymphocytes；apoptosis

R446

A

1000-2138（2011）04-0332-05

2010-01-07

浙江省科技計(jì)劃資助項(xiàng)目（2008C33059）。

姚蔚（1973-），女，浙江湖州人，實(shí)驗(yàn)師。

樓永良，教授，碩士生導(dǎo)師，Email：lyl@wzmc.edu.cn。

胡苗苗）

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