姚蔚,謝旦立,郭雅君,樓永良
(溫州醫(yī)學(xué)院 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院,浙江 溫州 325035)
創(chuàng)傷弧菌溶細(xì)胞素融合蛋白誘導(dǎo)人Jurkat-T淋巴細(xì)胞凋亡的研究
姚蔚,謝旦立,郭雅君,樓永良
(溫州醫(yī)學(xué)院 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院,浙江 溫州 325035)
目的:探討創(chuàng)傷弧菌溶細(xì)胞素融合蛋白(rVvhA)對(duì)人Jurkat T淋巴細(xì)胞凋亡的作用及凋亡過程中Caspase-3酶活性的變化。方法:利用基因工程方法體外表達(dá)、制備和純化rVvhA;MTT法檢測(cè)rVvhA對(duì)Jurkat T淋巴細(xì)胞的細(xì)胞毒活性影響;Annexin-V/PI雙染流式細(xì)胞儀檢測(cè)rVvhA誘導(dǎo)Jurkat T淋巴細(xì)胞凋亡情況;Hochest33258熒光染色激光共聚焦顯微鏡觀察rVvhA誘導(dǎo)Jurkat T細(xì)胞核形態(tài)的改變;分光光度法檢測(cè)凋亡過程中Caspase-3酶活性的變化。結(jié)果:純化復(fù)性后rVvhA的純度達(dá)到92%以上;MTT結(jié)果顯示rVvhA活性蛋白能顯著抑制Jurkat T淋巴細(xì)胞的生長(zhǎng),有效濃度為1.5 HU/mL;流式細(xì)胞儀和激光共聚焦檢測(cè)發(fā)現(xiàn)rVvhA作用后Jurkat T淋巴細(xì)胞核固縮,產(chǎn)生亮藍(lán)熒光,1.5 HU/mL rVvhA,作用4 h后即可有效誘導(dǎo)其凋亡,凋亡率為(39.13±3.33)%,對(duì)照組為(3.43±0.34)%,且能被Caspase全酶抑制劑一定程度抑制。1.5 HU/mL rVvhA作用Jurkat T淋巴細(xì)胞3 h,Caspase-3酶活性達(dá)到高峰。結(jié)論:rVvhA能損傷人Jurkat T淋巴細(xì)胞,誘導(dǎo)其發(fā)生細(xì)胞凋亡,Caspase-3可能在rVvhA誘導(dǎo)的Jurkat T細(xì)胞凋亡過程中起重要作用。
創(chuàng)傷弧菌溶細(xì)胞素;人Jurkat T淋巴細(xì)胞;細(xì)胞凋亡
創(chuàng)傷弧菌是一種革蘭染色陰性的嗜鹽性條件致病菌,對(duì)人類危害較大,感染后致死率達(dá)75%[1]。肝病患者等免疫功能低下的人群是其感染致病的主要高危人群。創(chuàng)傷弧菌感染后,短時(shí)間內(nèi)就會(huì)引起傷口炎癥,嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致敗血癥的發(fā)生。在該菌諸多的毒力因子中,創(chuàng)傷弧菌溶細(xì)胞素作為唯一分泌至胞外具有該菌種屬特異性的外毒素,是創(chuàng)傷弧菌感染的重要毒力因子之一。我們前期工作已證實(shí)了創(chuàng)傷弧菌溶細(xì)胞素融合蛋白rVvhA能誘導(dǎo)人ECV-304細(xì)胞凋亡和SMMC7721人肝癌細(xì)胞TNF-α、HSP90等炎癥因子基因的表達(dá)[1]。T淋巴細(xì)胞作為機(jī)體免疫系統(tǒng)的重要組成部分,對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)的平衡、監(jiān)控及抵御外界感染具有重要作用。綜合國(guó)內(nèi)外研究,本實(shí)驗(yàn)以人Jurkat T淋巴細(xì)胞為模型,通過研究創(chuàng)傷弧菌溶細(xì)胞素融合蛋白rVvhA對(duì)T細(xì)胞損傷的影響,對(duì)于了解創(chuàng)傷弧菌溶細(xì)胞素與T淋巴細(xì)胞間的作用、創(chuàng)傷弧菌感染時(shí)對(duì)T淋巴系統(tǒng)的影響以及創(chuàng)傷弧菌感染敗血癥的致病機(jī)制都具有積極意義。
1.1 材料
1.1.1 質(zhì)粒、菌株與紅細(xì)胞:大腸桿菌(E.coli)表達(dá)菌BL21(DE3)、重組表達(dá)載體pET28a(+)-vvhA由課題組保存及構(gòu)建,人急性淋巴性白血病Jurkat T淋巴細(xì)胞株由浙江省醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。1.1.2 主要試劑與試劑盒:Ni2+-NTA親和層析柱購(gòu)自上海申能生物科技有限公司;異丙基硫代β-D-半乳糖苷(IPTG)購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司;還原型谷胱甘肽(GSH)、氧化型谷胱甘肽(GSSH)、鹽酸胍均購(gòu)自BBI公司;RPMI1640液體培養(yǎng)基購(gòu)于美國(guó)Hyclone公司;細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、Caspase全酶抑制劑(Z-VAD-FMK)、MTT細(xì)胞毒性與增殖檢測(cè)試劑盒均購(gòu)于碧云天生物技術(shù)研究所;羊抗鼠多克隆抗體購(gòu)于北京天根生物技術(shù)有限公司。膜聯(lián)蛋白(Annexin)V-488/PI凋亡檢測(cè)試劑盒、Caspase-3分光光度法檢測(cè)試劑盒均購(gòu)于南京凱基生物技術(shù)有限公司。優(yōu)級(jí)胎牛血清購(gòu)于杭州四季青生物工程材料有限公司。
1.2 方法
1.2.1 創(chuàng)傷弧菌溶細(xì)胞素融合蛋白的表達(dá)、純化、復(fù)性及鑒定:參照文獻(xiàn)[7]進(jìn)行,終濃度為0.5 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)E.coliBL21(DE3)表達(dá)rVvhA,超聲破碎菌體分離粗提包涵體,經(jīng)三步洗滌,Ni2+-NTA親和層析柱梯度洗脫純化。純化后用復(fù)性液[55 mmol/L Tris-HCl(pH 6.0)、10.56 mmol/L NaCl、550 mmol/L精氨酸、0.44 mmol/L KCl、550 mmol/L鹽酸胍、1.1 mmol/L EDTA(pH 8.0)、440 mmol/L蔗糖、GSH:GSSH=10:1]結(jié)合分步透析法對(duì)rVvhA進(jìn)行復(fù)性。
1.2.2 人Jurkat T淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)傳代:Jurkat T淋巴細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%青/鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液中,置于37 ℃、5% CO2飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每2~3 d換液傳代。
1.2.3 MTT法測(cè)定Jurkat T細(xì)胞的增殖抑制率:選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Jurkat T淋巴細(xì)胞,接種于96孔培養(yǎng)板,調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104/mL,每孔100μL,分別加入終濃度為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 HU/mL的rVvhA活性蛋白,以未加rVvhA處理的細(xì)胞為對(duì)照組,置37 ℃、5% CO2條件培養(yǎng)4 h。加入10 mL MTT(5 mg/mL),37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h后,將96孔板11000 r/min離心5 min,小心吸棄培養(yǎng)液上清,每孔加入100 mL DMSO溶解formazon。檢測(cè)各孔570 nm吸光度值(每一組設(shè)3個(gè)重復(fù)孔),以表示細(xì)胞的存活情況。
1.2.4 Annexin-V/PI雙染檢測(cè)細(xì)胞凋亡:無血無抗RPMI1640預(yù)處理Jurkat T淋巴細(xì)胞24 h。進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分組,分別為培養(yǎng)液對(duì)照組、0.5 HU/mL rVvhA處理組、1.0 HU/mL rVvhA處理組、1.5 HU/mLrVvhA處理組、1.5 HU/mL+20μL Z-VAD-FMK處理組(ZVAD-FMK預(yù)處理Jurkat T淋巴細(xì)胞1 h),作用4 h后,收集不同處理組細(xì)胞。用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次,將細(xì)胞重懸于Binding Buffer中,依次加入5 mL 膜聯(lián)蛋白(Annexin)V-488及5 mL PI,混勻,室溫避光反應(yīng)15 min,1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率。
1.2.5 Hochest33258熒光染色觀察細(xì)胞核形態(tài):Jurkat T淋巴細(xì)胞先用無血無抗RPMI1640預(yù)處理培養(yǎng)24 h。將細(xì)胞分為對(duì)照組、1.5 HU/mL rVvhA組、Caspase全酶抑制劑預(yù)處理組。作用4 h后,收集不同處理組細(xì)胞,PBS洗滌,按Hochest33258細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒操作說明進(jìn)行細(xì)胞熒光染色。染色結(jié)束后,用PBS洗滌細(xì)胞,小心涂片,并用抗熒光猝滅封片液封片,使用激光共聚焦顯微鏡(×200)觀察細(xì)胞凋亡的細(xì)胞核形態(tài)。
1.2.6 分光光度法檢測(cè)Caspase-3活性變化:收集時(shí)間點(diǎn)為0、1、2、3、4 h對(duì)照組與濃度為1.5 HU/mL rVvhA處理組的Jurkat T淋巴細(xì)胞,PBS洗滌細(xì)胞2次,將細(xì)胞密度調(diào)整為5×106個(gè)/組。在收集的沉淀細(xì)胞中加入50 mL冰冷Lysis Buffer(使用前每50 mL Lysis Buffer加入0.5 mL DTT),吹打均勻。按照Caspase-3檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行操作。處理后的樣品加樣于96孔板,酶標(biāo)儀檢測(cè)λ=405 nm時(shí)的吸光值(OD)。通過計(jì)算ODrVvhA處理組/OD陰性對(duì)照來確定凋亡誘導(dǎo)劑組Caspase-3活化程度。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。多組間比較采用單因素方差分析,組內(nèi)兩兩比較采用LSD方法。
2.1 rVvhA包涵體的復(fù)性 純化后的rVvhA包涵體經(jīng)復(fù)性液復(fù)性結(jié)合透析復(fù)性后,復(fù)性率可達(dá)18%,復(fù)性后蛋白的分子量約為54 kDa。BandScan V5.0軟件分析后,復(fù)性后經(jīng)丙酮濃縮,蛋白的純度達(dá)92%以上(見圖1)。
圖1 復(fù)性后rVvhA SDS-PAGE分析圖
2.2 Jurkat T細(xì)胞存活率結(jié)果 人Jurkat T淋巴細(xì)胞經(jīng)不同濃度rVvhA活性蛋白作用4 h后,利用MTT法檢測(cè)吸光度值(見圖2),細(xì)胞的存活率以蛋白作用組細(xì)胞和對(duì)照組細(xì)胞吸光度平均值的比值來表示。從圖2可知,不同濃度的rVvhA活性蛋白作用Jurkat T細(xì)胞后,與對(duì)照組相比,0.5 HU/mL rVvhA作用組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),1、1.5、2、2.5 HU/mL組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Jurkat T細(xì)胞被2.0 HU/mL rVvhA作用后,細(xì)胞的存活率小于50%。
圖2 rVvhA活性蛋白對(duì)Jurkat T淋巴細(xì)胞存活率的影響
2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 Annexin-V和PI雙染后,通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同濃度rVvhA作用4 h后細(xì)胞凋亡的情況(見圖3-4)。從圖3-4可知,0.5 HU/mL rVvhA作用組與對(duì)照組比,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。1、1.5 HU/mL rVvhA處理后,凋亡率分別為(21.60±2.17)%、(39.13±3.33)%,且呈劑量依賴性。20μmol/L Z-VAD-FMK預(yù)處理細(xì)胞后,細(xì)胞凋亡率與1.5 HU/mL rVvhA處理組相比,明顯下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
圖3 不同濃度rVvhA作用Jurkat T淋巴細(xì)胞經(jīng)膜聯(lián)蛋白V-488和PI雙染后流式凋亡檢測(cè)結(jié)果
圖4 不同濃度rVvhA作用Jurkat T淋巴細(xì)胞流式檢測(cè)凋亡分析圖
2.4 rVvhA對(duì)Jurkat T細(xì)胞核形態(tài)的影響 Hochest33258熒光染色后(見圖5),正常細(xì)胞核呈彌散均勻的藍(lán)色熒光,呈圓形,染色質(zhì)分布均勻。1.5 HU/mL rVvhA處理組出現(xiàn)細(xì)胞核致密固縮,破裂塊狀,發(fā)亮藍(lán)(或發(fā)白)熒光染色等凋亡核形態(tài)變化。Caspase全酶抑制劑預(yù)處理組中,其亮藍(lán)熒光細(xì)胞數(shù)目有所下降。Caspase全酶抑制劑對(duì)rVvhA誘導(dǎo)Jurkat T淋巴細(xì)胞凋亡具有一定的抑制作用。
圖5 rVvhA作用Jurkat T淋巴細(xì)胞4 h后Hochest33258染色結(jié)果(×200)
2.5 rVvhA誘導(dǎo)Jurkat T淋巴細(xì)胞凋亡過程中Caspase-3活性變化 圖6所示,經(jīng)1.5 HU/mL rVvhA處理Jurkat T淋巴細(xì)胞1 h后,Caspase-3活性相比對(duì)照組逐漸開始升高。在作用時(shí)間4 h內(nèi),Caspase-3活性于3 h時(shí)達(dá)高峰,與對(duì)照組比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
圖6 不同時(shí)間rVvhA對(duì)Jurkat T細(xì)胞Caspase-3酶活性的影響
創(chuàng)傷弧菌溶細(xì)胞素已被證實(shí)對(duì)多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞具有細(xì)胞毒作用,如血管內(nèi)皮細(xì)胞、紅細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等。前期的工作,我們已證實(shí)體外表達(dá)的rVvhA溶血活性為0.2μg/HU[1]。創(chuàng)傷弧菌感染能引起嚴(yán)重的原發(fā)性敗血癥,到目前為止,該溶細(xì)胞素對(duì)淋巴細(xì)胞損傷及損傷機(jī)制目前尚未明確。Kim等[5]以Jurkat T淋巴細(xì)胞株為例,證實(shí)創(chuàng)傷弧菌能通過ROS升高和激活MAPK信號(hào)通路殺傷人Jurkat T淋巴細(xì)胞,但并未涉及具體創(chuàng)傷弧菌哪些致病因子與其殺傷Jurkat T淋巴細(xì)胞有關(guān)。本課題組已證實(shí)體外重組的創(chuàng)傷弧菌溶細(xì)胞素亦能引起人ECV304細(xì)胞發(fā)生凋亡[2]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)體外重組的創(chuàng)傷弧菌溶細(xì)胞素rVvhA對(duì)人Jurkat T淋巴細(xì)胞有明顯的細(xì)胞毒性,可抑制其生長(zhǎng);4 h的中效濃度(effective concentration for 50%inhibition,EC50)為1.5 HU/mL,低于此濃度時(shí)生長(zhǎng)抑制不明顯,而高于該濃度時(shí),細(xì)胞生長(zhǎng)受到顯著抑制。因此,我們選用此濃度作用人Jurkat T淋巴細(xì)胞。在本實(shí)驗(yàn)中,經(jīng)1.5 HU/mL rVvhA處理人Jurkat T淋巴細(xì)胞4 h后,經(jīng)Hoechst33258熒光染色可觀察到明顯的細(xì)胞凋亡的核形態(tài)學(xué)改變(核固縮、染色質(zhì)聚集、邊緣化等),流式細(xì)胞儀檢測(cè)其誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率為(37.10±0.70)%,說明1.5 HU/mL rVvhA作用濃度較合適誘導(dǎo)人Jurkat T淋巴細(xì)胞凋亡。Caspase全酶抑制劑能一定程度抑制由rVvhA誘導(dǎo)的Jurkat T淋巴細(xì)胞凋亡,rVvhA誘導(dǎo)的Jurkat T細(xì)胞凋亡可能亦于Caspase家族有關(guān)。因此,我們推測(cè),創(chuàng)傷弧菌溶細(xì)胞素可能是創(chuàng)傷弧菌殺傷T淋巴細(xì)胞、Jurkat T淋巴細(xì)胞的重要致病因子,可直接參與創(chuàng)傷弧菌對(duì)T淋巴細(xì)胞的殺傷。
研究表明多種基因參與細(xì)胞凋亡的調(diào)控,而Caspase蛋白的表達(dá)是各種細(xì)胞凋亡機(jī)制的最后共同通路。在細(xì)胞凋亡的信號(hào)傳遞中,Caspase家族居于重要地位, 激活的Caspase可以水解包括細(xì)胞調(diào)節(jié)、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、DNA修復(fù)等環(huán)節(jié)中重要的蛋白, 從而使細(xì)胞表現(xiàn)為凋亡特有的形態(tài)學(xué)及生化特征:細(xì)胞皺縮、斷裂,染色質(zhì)聚集,DNA降解等。Caspase處于凋亡誘導(dǎo)信號(hào)傳遞、Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)、下游效應(yīng)因子作用這一凋亡過程中的中心位置。目前認(rèn)為,在Caspase家族中,Caspase-1、Caspase-11和Caspase-4被認(rèn)為不直接參與凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),它們主要參與白介素前體的活化;而Caspase-2,Caspase-8,Caspase-9和Caspase-10參與細(xì)胞凋亡的起始;參與執(zhí)行的是Caspase-3,Caspase-6和Caspase-7。故我們利用分光光度法檢測(cè)rVvhA誘導(dǎo)的Jurkat T淋巴細(xì)胞凋亡中Caspase-3的活化情況,以進(jìn)一步明確和了解創(chuàng)傷弧菌溶細(xì)胞素對(duì)人Jurkat T淋巴細(xì)胞凋亡的影響。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),當(dāng)1.5 HU/mL rVvhA作用Jurkat T細(xì)胞3 h后,Caspase-3活性達(dá)到峰值。
本實(shí)驗(yàn)證實(shí)并發(fā)現(xiàn),創(chuàng)傷弧菌溶細(xì)胞素能直接殺傷Jurkat T淋巴細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)中利用1.5 HU/mL rvvhA 3~4 h,既能引起Jurkat T細(xì)胞發(fā)生明顯的凋亡反應(yīng),Caspase-3的酶活性達(dá)到峰值,其殺傷效果與殺傷HUVEC及ECV304相比,對(duì)淋巴細(xì)胞顯得更為敏感。因此,我們推斷溶細(xì)胞素對(duì)靶細(xì)胞的殺傷可能存在組織細(xì)胞特異性,可能與其致病時(shí)菌株攻擊的靶器官或臨床癥狀相關(guān)。而淋巴細(xì)胞亦可能是創(chuàng)傷弧菌攻擊的重要靶細(xì)胞。此外,無論在血管內(nèi)皮細(xì)胞還是淋巴細(xì)胞中,我們發(fā)現(xiàn)溶細(xì)胞素引起的靶細(xì)胞凋亡涉及內(nèi)源性和死亡受體介導(dǎo)的凋亡通路,但由于Jurkat T細(xì)胞是天然PTEN缺陷型細(xì)胞株,PTEN能直接作用PI3K信號(hào)通路,其缺失可能引起AKT磷酸化的增加,AKT是細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中極為重要的信號(hào)分子,與細(xì)胞的增殖等有密切的關(guān)系。因此,Jurkat T淋巴細(xì)胞對(duì)溶細(xì)胞素相比ECV304更為敏感是否意味著可能與PTEN涉及的AKT、PI3K、mTOR信號(hào)通路有關(guān)。若構(gòu)建PTEN表達(dá)載體轉(zhuǎn)染Jurkat T細(xì)胞后是否能降低溶細(xì)胞素對(duì)其的損傷,值得我們思考。綜上,我們推測(cè),創(chuàng)傷弧菌溶細(xì)胞素可能是創(chuàng)傷弧菌殺傷T淋巴細(xì)胞,Jurkat T淋巴細(xì)胞重要致病因子,可直接參與創(chuàng)傷弧菌對(duì)T淋巴細(xì)胞的殺傷,但其對(duì)細(xì)胞的損傷是否涉及Caspase家族有關(guān)凋亡通路,溶細(xì)胞素對(duì)T淋巴細(xì)胞影響的具體分子機(jī)制,還有待深入了解。因此,本實(shí)驗(yàn)為明確創(chuàng)傷弧菌溶細(xì)胞素對(duì)免疫細(xì)胞的殺傷作用,為進(jìn)一步了解及完善創(chuàng)傷弧菌的致病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
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Study on the apoptosis of human Jurkat T-lymphocytes induced by recombinant Vibrio vulnificus cytolysin
YAO Wei,XIE Danli,GUO Yajun,LOU Yongliang.
School of Life Science,
School of Laboratory Medicine,Wenzhou Medical College,Wenzhou,325035
Objective:To study the effect of recombinant Vibrio vulnificus cytolysin(rVvhA)on the activity of Caspase-3 and apoptosis in Jurkat T-cells. Method:The growth inhibition of Jurkat T-lymphocytes was measured by MTT assay. The effect of rVvhA on induction of apoptosis of Jurkat T-lymphocytes was studied by Hochest33258 stain and flow cytometry(FCM),respectively. Commercially available colorimetric assay kit was used to measure the activity of caspase-3 based on the spectrophotometric method.Results:Refolded rVvhA was purified with high purity up to 92%;the viability of Jurkat T-cells treated with 1.5 HU/mL rVvhA was inhibited significantly;1.5 HU/mL rVvhA could significantly induce apoptosis on Jurkat T-cells. After treatment with 1.5 HU/mL rVvhA at various times,the activity of Caspase-3 in Jurkat T-cells reached the peak at 3 h.Conclusion:The apoptosis of Jurkat T-cells can be induced by rVvhA, Caspase-3 may play a major role in the apoptosis of rVvhA-exposed cells.
Vibrio vulnificus cytolysin;human Jurkat T-lymphocytes;apoptosis
R446
A
1000-2138(2011)04-0332-05
2010-01-07
浙江省科技計(jì)劃資助項(xiàng)目(2008C33059)。
姚蔚(1973-),女,浙江湖州人,實(shí)驗(yàn)師。
樓永良,教授,碩士生導(dǎo)師,Email:lyl@wzmc.edu.cn。
胡苗苗)
·論 著·