姚蔚，謝旦立，郭雅君，樓永良

（溫州醫(yī)學院 檢驗醫(yī)學院，浙江 溫州 325035）

創(chuàng)傷弧菌溶細胞素融合蛋白誘導人Jurkat-T淋巴細胞凋亡的研究

姚蔚，謝旦立，郭雅君，樓永良

（溫州醫(yī)學院 檢驗醫(yī)學院，浙江 溫州 325035）

目的：探討創(chuàng)傷弧菌溶細胞素融合蛋白（rVvhA）對人Jurkat T淋巴細胞凋亡的作用及凋亡過程中Caspase-3酶活性的變化。方法：利用基因工程方法體外表達、制備和純化rVvhA；MTT法檢測rVvhA對Jurkat T淋巴細胞的細胞毒活性影響；Annexin-V/PI雙染流式細胞儀檢測rVvhA誘導Jurkat T淋巴細胞凋亡情況；Hochest33258熒光染色激光共聚焦顯微鏡觀察rVvhA誘導Jurkat T細胞核形態(tài)的改變；分光光度法檢測凋亡過程中Caspase-3酶活性的變化。結果：純化復性后rVvhA的純度達到92%以上；MTT結果顯示rVvhA活性蛋白能顯著抑制Jurkat T淋巴細胞的生長，有效濃度為1.5 HU/mL；流式細胞儀和激光共聚焦檢測發(fā)現(xiàn)rVvhA作用后Jurkat T淋巴細胞核固縮，產(chǎn)生亮藍熒光，1.5 HU/mL rVvhA，作用4 h后即可有效誘導其凋亡，凋亡率為（39.13±3.33）%，對照組為（3.43±0.34）%，且能被Caspase全酶抑制劑一定程度抑制。1.5 HU/mL rVvhA作用Jurkat T淋巴細胞3 h，Caspase-3酶活性達到高峰。結論：rVvhA能損傷人Jurkat T淋巴細胞，誘導其發(fā)生細胞凋亡，Caspase-3可能在rVvhA誘導的Jurkat T細胞凋亡過程中起重要作用。

創(chuàng)傷弧菌溶細胞素；人Jurkat T淋巴細胞；細胞凋亡

創(chuàng)傷弧菌是一種革蘭染色陰性的嗜鹽性條件致病菌，對人類危害較大，感染后致死率達75%[1]。肝病患者等免疫功能低下的人群是其感染致病的主要高危人群。創(chuàng)傷弧菌感染后，短時間內就會引起傷口炎癥，嚴重時會導致敗血癥的發(fā)生。在該菌諸多的毒力因子中，創(chuàng)傷弧菌溶細胞素作為唯一分泌至胞外具有該菌種屬特異性的外毒素，是創(chuàng)傷弧菌感染的重要毒力因子之一。我們前期工作已證實了創(chuàng)傷弧菌溶細胞素融合蛋白rVvhA能誘導人ECV-304細胞凋亡和SMMC7721人肝癌細胞TNF-α、HSP90等炎癥因子基因的表達[1]。T淋巴細胞作為機體免疫系統(tǒng)的重要組成部分，對機體免疫系統(tǒng)的平衡、監(jiān)控及抵御外界感染具有重要作用。綜合國內外研究，本實驗以人Jurkat T淋巴細胞為模型，通過研究創(chuàng)傷弧菌溶細胞素融合蛋白rVvhA對T細胞損傷的影響，對于了解創(chuàng)傷弧菌溶細胞素與T淋巴細胞間的作用、創(chuàng)傷弧菌感染時對T淋巴系統(tǒng)的影響以及創(chuàng)傷弧菌感染敗血癥的致病機制都具有積極意義。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 質粒、菌株與紅細胞：大腸桿菌（E.coli）表達菌BL21（DE3）、重組表達載體pET28a（+）-vvhA由課題組保存及構建，人急性淋巴性白血病Jurkat T淋巴細胞株由浙江省醫(yī)學遺傳學重點實驗室提供。1.1.2 主要試劑與試劑盒：Ni2+-NTA親和層析柱購自上海申能生物科技有限公司；異丙基硫代β-D-半乳糖苷（IPTG）購自寶生物工程（大連）有限公司；還原型谷胱甘肽（GSH）、氧化型谷胱甘肽（GSSH）、鹽酸胍均購自BBI公司；RPMI1640液體培養(yǎng)基購于美國Hyclone公司；細胞凋亡檢測試劑盒、Caspase全酶抑制劑（Z-VAD-FMK）、MTT細胞毒性與增殖檢測試劑盒均購于碧云天生物技術研究所；羊抗鼠多克隆抗體購于北京天根生物技術有限公司。膜聯(lián)蛋白（Annexin）V-488/PI凋亡檢測試劑盒、Caspase-3分光光度法檢測試劑盒均購于南京凱基生物技術有限公司。優(yōu)級胎牛血清購于杭州四季青生物工程材料有限公司。

1.2 方法

1.2.1 創(chuàng)傷弧菌溶細胞素融合蛋白的表達、純化、復性及鑒定：參照文獻[7]進行，終濃度為0.5 mmol/L的IPTG誘導E.coliBL21（DE3）表達rVvhA，超聲破碎菌體分離粗提包涵體，經(jīng)三步洗滌，Ni2+-NTA親和層析柱梯度洗脫純化。純化后用復性液[55 mmol/L Tris-HCl（pH 6.0）、10.56 mmol/L NaCl、550 mmol/L精氨酸、0.44 mmol/L KCl、550 mmol/L鹽酸胍、1.1 mmol/L EDTA（pH 8.0）、440 mmol/L蔗糖、GSH:GSSH=10:1]結合分步透析法對rVvhA進行復性。

1.2.2 人Jurkat T淋巴細胞的培養(yǎng)傳代：Jurkat T淋巴細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%青/鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液中，置于37 ℃、5% CO2飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3 d換液傳代。

1.2.3 MTT法測定Jurkat T細胞的增殖抑制率：選擇對數(shù)生長期Jurkat T淋巴細胞，接種于96孔培養(yǎng)板，調整細胞濃度為5×104/mL，每孔100μL，分別加入終濃度為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 HU/mL的rVvhA活性蛋白，以未加rVvhA處理的細胞為對照組，置37 ℃、5% CO2條件培養(yǎng)4 h。加入10 mL MTT（5 mg/mL），37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，將96孔板11000 r/min離心5 min，小心吸棄培養(yǎng)液上清，每孔加入100 mL DMSO溶解formazon。檢測各孔570 nm吸光度值（每一組設3個重復孔），以表示細胞的存活情況。

1.2.4 Annexin-V/PI雙染檢測細胞凋亡：無血無抗RPMI1640預處理Jurkat T淋巴細胞24 h。進行實驗分組，分別為培養(yǎng)液對照組、0.5 HU/mL rVvhA處理組、1.0 HU/mL rVvhA處理組、1.5 HU/mLrVvhA處理組、1.5 HU/mL+20μL Z-VAD-FMK處理組（ZVAD-FMK預處理Jurkat T淋巴細胞1 h），作用4 h后，收集不同處理組細胞。用預冷的PBS洗滌細胞2次，將細胞重懸于Binding Buffer中，依次加入5 mL 膜聯(lián)蛋白（Annexin）V-488及5 mL PI，混勻，室溫避光反應15 min，1 h內用流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率。

1.2.5 Hochest33258熒光染色觀察細胞核形態(tài)：Jurkat T淋巴細胞先用無血無抗RPMI1640預處理培養(yǎng)24 h。將細胞分為對照組、1.5 HU/mL rVvhA組、Caspase全酶抑制劑預處理組。作用4 h后，收集不同處理組細胞，PBS洗滌，按Hochest33258細胞凋亡檢測試劑盒操作說明進行細胞熒光染色。染色結束后，用PBS洗滌細胞，小心涂片，并用抗熒光猝滅封片液封片，使用激光共聚焦顯微鏡（×200）觀察細胞凋亡的細胞核形態(tài)。

1.2.6 分光光度法檢測Caspase-3活性變化：收集時間點為0、1、2、3、4 h對照組與濃度為1.5 HU/mL rVvhA處理組的Jurkat T淋巴細胞，PBS洗滌細胞2次，將細胞密度調整為5×106個/組。在收集的沉淀細胞中加入50 mL冰冷Lysis Buffer（使用前每50 mL Lysis Buffer加入0.5 mL DTT），吹打均勻。按照Caspase-3檢測試劑盒說明書進行操作。處理后的樣品加樣于96孔板，酶標儀檢測λ=405 nm時的吸光值（OD）。通過計算ODrVvhA處理組/OD陰性對照來確定凋亡誘導劑組Caspase-3活化程度。以上實驗重復3次。

1.3 統(tǒng)計學處理方法 采用SPSS16.0軟件進行統(tǒng)計學分析。多組間比較采用單因素方差分析，組內兩兩比較采用LSD方法。

2 結果

2.1 rVvhA包涵體的復性 純化后的rVvhA包涵體經(jīng)復性液復性結合透析復性后，復性率可達18%，復性后蛋白的分子量約為54 kDa。BandScan V5.0軟件分析后，復性后經(jīng)丙酮濃縮，蛋白的純度達92%以上（見圖1）。

圖1 復性后rVvhA SDS-PAGE分析圖

2.2 Jurkat T細胞存活率結果 人Jurkat T淋巴細胞經(jīng)不同濃度rVvhA活性蛋白作用4 h后，利用MTT法檢測吸光度值（見圖2），細胞的存活率以蛋白作用組細胞和對照組細胞吸光度平均值的比值來表示。從圖2可知，不同濃度的rVvhA活性蛋白作用Jurkat T細胞后，與對照組相比，0.5 HU/mL rVvhA作用組差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），1、1.5、2、2.5 HU/mL組間差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。Jurkat T細胞被2.0 HU/mL rVvhA作用后，細胞的存活率小于50%。

圖2 rVvhA活性蛋白對Jurkat T淋巴細胞存活率的影響

2.3 流式細胞儀檢測細胞凋亡率 Annexin-V和PI雙染后，通過流式細胞儀檢測不同濃度rVvhA作用4 h后細胞凋亡的情況（見圖3-4）。從圖3-4可知，0.5 HU/mL rVvhA作用組與對照組比，差異無統(tǒng)計學意義。1、1.5 HU/mL rVvhA處理后，凋亡率分別為（21.60±2.17）%、（39.13±3.33）%，且呈劑量依賴性。20μmol/L Z-VAD-FMK預處理細胞后，細胞凋亡率與1.5 HU/mL rVvhA處理組相比，明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

圖3 不同濃度rVvhA作用Jurkat T淋巴細胞經(jīng)膜聯(lián)蛋白V-488和PI雙染后流式凋亡檢測結果

圖4 不同濃度rVvhA作用Jurkat T淋巴細胞流式檢測凋亡分析圖

2.4 rVvhA對Jurkat T細胞核形態(tài)的影響 Hochest33258熒光染色后（見圖5），正常細胞核呈彌散均勻的藍色熒光，呈圓形，染色質分布均勻。1.5 HU/mL rVvhA處理組出現(xiàn)細胞核致密固縮，破裂塊狀，發(fā)亮藍（或發(fā)白）熒光染色等凋亡核形態(tài)變化。Caspase全酶抑制劑預處理組中，其亮藍熒光細胞數(shù)目有所下降。Caspase全酶抑制劑對rVvhA誘導Jurkat T淋巴細胞凋亡具有一定的抑制作用。

圖5 rVvhA作用Jurkat T淋巴細胞4 h后Hochest33258染色結果（×200）

2.5 rVvhA誘導Jurkat T淋巴細胞凋亡過程中Caspase-3活性變化 圖6所示，經(jīng)1.5 HU/mL rVvhA處理Jurkat T淋巴細胞1 h后，Caspase-3活性相比對照組逐漸開始升高。在作用時間4 h內，Caspase-3活性于3 h時達高峰，與對照組比，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

圖6 不同時間rVvhA對Jurkat T細胞Caspase-3酶活性的影響

3 討論

創(chuàng)傷弧菌溶細胞素已被證實對多種哺乳動物細胞具有細胞毒作用，如血管內皮細胞、紅細胞、血管平滑肌細胞、巨噬細胞等。前期的工作，我們已證實體外表達的rVvhA溶血活性為0.2μg/HU[1]。創(chuàng)傷弧菌感染能引起嚴重的原發(fā)性敗血癥，到目前為止，該溶細胞素對淋巴細胞損傷及損傷機制目前尚未明確。Kim等[5]以Jurkat T淋巴細胞株為例，證實創(chuàng)傷弧菌能通過ROS升高和激活MAPK信號通路殺傷人Jurkat T淋巴細胞，但并未涉及具體創(chuàng)傷弧菌哪些致病因子與其殺傷Jurkat T淋巴細胞有關。本課題組已證實體外重組的創(chuàng)傷弧菌溶細胞素亦能引起人ECV304細胞發(fā)生凋亡[2]。本實驗結果發(fā)現(xiàn)體外重組的創(chuàng)傷弧菌溶細胞素rVvhA對人Jurkat T淋巴細胞有明顯的細胞毒性，可抑制其生長；4 h的中效濃度（effective concentration for 50%inhibition，EC50）為1.5 HU/mL，低于此濃度時生長抑制不明顯，而高于該濃度時，細胞生長受到顯著抑制。因此，我們選用此濃度作用人Jurkat T淋巴細胞。在本實驗中，經(jīng)1.5 HU/mL rVvhA處理人Jurkat T淋巴細胞4 h后，經(jīng)Hoechst33258熒光染色可觀察到明顯的細胞凋亡的核形態(tài)學改變（核固縮、染色質聚集、邊緣化等），流式細胞儀檢測其誘導的細胞凋亡率為（37.10±0.70）%，說明1.5 HU/mL rVvhA作用濃度較合適誘導人Jurkat T淋巴細胞凋亡。Caspase全酶抑制劑能一定程度抑制由rVvhA誘導的Jurkat T淋巴細胞凋亡，rVvhA誘導的Jurkat T細胞凋亡可能亦于Caspase家族有關。因此，我們推測，創(chuàng)傷弧菌溶細胞素可能是創(chuàng)傷弧菌殺傷T淋巴細胞、Jurkat T淋巴細胞的重要致病因子，可直接參與創(chuàng)傷弧菌對T淋巴細胞的殺傷。

研究表明多種基因參與細胞凋亡的調控，而Caspase蛋白的表達是各種細胞凋亡機制的最后共同通路。在細胞凋亡的信號傳遞中，Caspase家族居于重要地位， 激活的Caspase可以水解包括細胞調節(jié)、細胞信號轉導、DNA修復等環(huán)節(jié)中重要的蛋白， 從而使細胞表現(xiàn)為凋亡特有的形態(tài)學及生化特征：細胞皺縮、斷裂，染色質聚集，DNA降解等。Caspase處于凋亡誘導信號傳遞、Caspase級聯(lián)反應、下游效應因子作用這一凋亡過程中的中心位置。目前認為，在Caspase家族中，Caspase-1、Caspase-11和Caspase-4被認為不直接參與凋亡信號轉導，它們主要參與白介素前體的活化；而Caspase-2，Caspase-8，Caspase-9和Caspase-10參與細胞凋亡的起始；參與執(zhí)行的是Caspase-3，Caspase-6和Caspase-7。故我們利用分光光度法檢測rVvhA誘導的Jurkat T淋巴細胞凋亡中Caspase-3的活化情況，以進一步明確和了解創(chuàng)傷弧菌溶細胞素對人Jurkat T淋巴細胞凋亡的影響。本實驗發(fā)現(xiàn)，當1.5 HU/mL rVvhA作用Jurkat T細胞3 h后，Caspase-3活性達到峰值。

本實驗證實并發(fā)現(xiàn)，創(chuàng)傷弧菌溶細胞素能直接殺傷Jurkat T淋巴細胞。實驗中利用1.5 HU/mL rvvhA 3～4 h，既能引起Jurkat T細胞發(fā)生明顯的凋亡反應，Caspase-3的酶活性達到峰值，其殺傷效果與殺傷HUVEC及ECV304相比，對淋巴細胞顯得更為敏感。因此，我們推斷溶細胞素對靶細胞的殺傷可能存在組織細胞特異性，可能與其致病時菌株攻擊的靶器官或臨床癥狀相關。而淋巴細胞亦可能是創(chuàng)傷弧菌攻擊的重要靶細胞。此外，無論在血管內皮細胞還是淋巴細胞中，我們發(fā)現(xiàn)溶細胞素引起的靶細胞凋亡涉及內源性和死亡受體介導的凋亡通路，但由于Jurkat T細胞是天然PTEN缺陷型細胞株，PTEN能直接作用PI3K信號通路，其缺失可能引起AKT磷酸化的增加，AKT是細胞信號轉導中極為重要的信號分子，與細胞的增殖等有密切的關系。因此，Jurkat T淋巴細胞對溶細胞素相比ECV304更為敏感是否意味著可能與PTEN涉及的AKT、PI3K、mTOR信號通路有關。若構建PTEN表達載體轉染Jurkat T細胞后是否能降低溶細胞素對其的損傷，值得我們思考。綜上，我們推測，創(chuàng)傷弧菌溶細胞素可能是創(chuàng)傷弧菌殺傷T淋巴細胞，Jurkat T淋巴細胞重要致病因子，可直接參與創(chuàng)傷弧菌對T淋巴細胞的殺傷，但其對細胞的損傷是否涉及Caspase家族有關凋亡通路，溶細胞素對T淋巴細胞影響的具體分子機制，還有待深入了解。因此，本實驗為明確創(chuàng)傷弧菌溶細胞素對免疫細胞的殺傷作用，為進一步了解及完善創(chuàng)傷弧菌的致病機制奠定基礎。

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Study on the apoptosis of human Jurkat T-lymphocytes induced by recombinant Vibrio vulnificus cytolysin

YAO Wei，XIE Danli，GUO Yajun，LOU Yongliang.
School of Life Science，

School of Laboratory Medicine，Wenzhou Medical College，Wenzhou，325035

Objective:To study the effect of recombinant Vibrio vulnificus cytolysin（rVvhA）on the activity of Caspase-3 and apoptosis in Jurkat T-cells. Method:The growth inhibition of Jurkat T-lymphocytes was measured by MTT assay. The effect of rVvhA on induction of apoptosis of Jurkat T-lymphocytes was studied by Hochest33258 stain and flow cytometry（FCM），respectively. Commercially available colorimetric assay kit was used to measure the activity of caspase-3 based on the spectrophotometric method.Results:Refolded rVvhA was purified with high purity up to 92%；the viability of Jurkat T-cells treated with 1.5 HU/mL rVvhA was inhibited significantly；1.5 HU/mL rVvhA could significantly induce apoptosis on Jurkat T-cells. After treatment with 1.5 HU/mL rVvhA at various times，the activity of Caspase-3 in Jurkat T-cells reached the peak at 3 h.Conclusion:The apoptosis of Jurkat T-cells can be induced by rVvhA， Caspase-3 may play a major role in the apoptosis of rVvhA-exposed cells.

Vibrio vulnificus cytolysin；human Jurkat T-lymphocytes；apoptosis

R446

A

1000-2138（2011）04-0332-05

2010-01-07

浙江省科技計劃資助項目（2008C33059）。

姚蔚（1973-），女，浙江湖州人，實驗師。

樓永良，教授，碩士生導師，Email：lyl@wzmc.edu.cn。

胡苗苗）

·論 著·