王雪蓮,盧 巖,安春麗

(1.中國醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院病原生物學教研室,遼寧沈陽 110001;2.中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院院感科,遼寧沈陽 110004)

人乳頭瘤病毒(human papillamavirus,HPV)是一組嗜上皮組織的雙鏈DNA病毒。HPV僅感染局部的皮膚和黏膜上皮細胞,不入血,因而外周血中抗原特異性T淋巴細胞的數量少,抗原特異性記憶T細胞的數量更少。本研究收集HPV自發(fā)清除者(病毒清除后74個月)外周血單個核細胞,抗原肽刺激后,采用EL ISPOT方法,檢測記憶T細胞分泌IFN-γ的能力,以明確外周血中記憶T細胞的數量和功能。該結果可為后續(xù)檢測HPV持續(xù)感染者或宮頸癌患者體內抗原特異性的記憶T細胞奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

RPM I1640培養(yǎng)基、人血清、Ficoll淋巴細胞分離液購自Fisher公司;Multiscreen 96孔板購自美國Millipore公司; IL-2、IFN-γ單克隆抗體和生物素標記的Anti-IFN-γ單克隆抗體購自瑞典Mabtech公司;avidin-bound biotinylated horseradish peroxidase購自Vector Laboratories公司;EL ISPOT分析儀為Cell Technology公司產品。

1.2 方法

1.2.1 PBMC細胞的分離 HPV自發(fā)清除后74個月收集靜脈血40 mL,Ficoll淋巴細胞分離液分離外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC),計數凍存。

1.2.2 抗原肽刺激PBMC,體外培養(yǎng) 前期實驗已經證實此病毒自發(fā)清除者體內存在HPV16 E6 133-142表位特異性T細胞[1]。凍存的PBMC常規(guī)復蘇,檢測細胞活性,用含10%人血清的RPM I 1640培養(yǎng)基(RP-10H)過夜培養(yǎng)細胞(濃度為2×106/mL)。收集后計數細胞,將細胞以1×106/mL/孔置于24孔板中,應用抗原肽(HPV16 E6 133-142;10μmol/L)刺激PBMC細胞,置37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。第3天,每孔加 IL-2(1 800 U/mL)。第7天,每孔加含 IL-2的RP-10H 1 mL。第10天,收集細胞,用RP-10H洗滌細胞,去除抗原肽和 IL-2,RP-10H繼續(xù)培養(yǎng)細胞。第11天,細胞計數后進行EL ISPOT實驗。

1.2.3 EL ISPOT檢測表位特異性記憶T細胞應用EL ISPOT方法,以EBV轉化的B淋巴母細胞系[2](lymphoblastoid cell line,LCL)作為抗原遞呈細胞(antigen presenting cells,APC),以HPV16 E6 133-142為抗原,檢測未經抗原刺激的PBMC和經抗原刺激11 d的PBMC中分泌產生IFN-γ的抗原特異性T細胞,同時設置陽性和陰性對照。EL ISPOT步驟參考文獻[1]。用IFN-γ單克隆抗體(5μg/mL)包被Multiscreen 96孔板,4℃冰箱中過夜。次日棄包被液,PBS洗3次。用含5%人血清的RPM I 1640培養(yǎng)基(RP-5H;50μL/孔)37℃封閉2 h。每孔加入50μL LCL細胞(5×105/孔)、50μL PBMC(5×104/孔),50μL HPV E6 133-142(10μmol/L),實驗設陽性(PHA)和陰性對照(RP-5H)。每一條件設3個平行孔。平板置37℃細胞培養(yǎng)箱中過夜。PBS洗3次后,加入生物素標記的Anti-IFN-γ單克隆抗體(1μg/mL),37℃孵育2 h。PBS洗3次后,加入avidinbound biotinylated horseradish peroxidase,37℃孵育1 h。PBS洗3次后,diaminobenzene顯色。去離子水終止顯色。EL ISPOT分析儀計數斑點數量。計算每一條件斑點數量的平均值作圖。

2 結果與分析

2.1 細胞計數

常規(guī)復蘇PBMC,過夜培養(yǎng)后,計數細胞,活細胞數為4.1×105,抗原肽刺激10 d后,細胞數增加為4.2×106,為抗原刺激前細胞數的10.2倍。第11天,細胞數為4.65×106,為抗原刺激前細胞數的11.3倍。

2.2 EL ISPOT檢測PBMC中的記憶T細胞

圖1 EL ISPOT檢測經抗原刺激的PB MC中HPV特異性的T細胞Fig.1 HPV-specific T cells in antigen-stimulated PBMC by EL ISPOT

EL ISPOT結果顯示,PBMC中的記憶T細胞經抗原刺激后活化為效應細胞,能夠識別APC遞呈的抗原肽HPV16 E6 133-142,并分泌IFN-γ(圖1)。而未經抗原刺激的PBMC不能識別APC遞呈的抗原肽(圖2)。通過計數斑點數量,推算PBMC中抗原特異性的記憶T細胞的頻數。公式如下:記憶T細胞的頻數=(計數抗原肽刺激孔斑點數量-陰性對照孔斑點數量)÷PBMC數量÷細胞增加倍數。此HPV自發(fā)清除者外周血中抗原特異性的記憶T細胞的頻數為(69-30)÷(5×104)÷11.3=0.007%。

圖2 EL ISPOT檢測未經抗原刺激的PBMC中HPV特異性的T細胞Fig.2 HPV-specific T cells in antigen-unstimulated PBMC by EL ISPOT

3 討 論

機體內的初始T細胞識別抗原遞呈細胞遞呈的抗原后,可被激活,分化為效應T細胞[3]。當機體清除抗原,效應細胞中的一部分可分化轉為記憶T細胞。當再次接觸相同抗原時,抗原特異性的記憶T細胞可迅速增殖分化為效應T細胞[4-5]。相較于初始T細胞,記憶T細胞具有較低的活化閾值和較強的效應功能。因此在防止病原菌的再感染過程中,記憶T細胞反應迅速,功能強大,發(fā)揮重要作用[6]。

體外抗原刺激可活化PBMC中的記憶T細胞[7-8]。本實驗采用已經鑒定的表位肽HPV16 E6133-142[1]刺激HPV自發(fā)清除者(HPV清除后74個月)的PBMC,使其中的記憶T細胞增殖分化為效應細胞。通過細胞計數,發(fā)現(xiàn)抗原刺激11 d后,細胞數量增加11.3倍,表明PBMC中含有HPV16 E6133-142特異性的記憶T細胞,此T細胞經特異性抗原肽激活后,分化為效應細胞,細胞分裂增殖,數量增加。

EL ISPOT可以從100萬個細胞中檢測出單個分泌細胞,具有較高的可靠性、重復性及敏感性。本研究應用EL ISPOT方法檢測活化的記憶T細胞中分泌IFN-γ的T細胞的數量,來推算PBMC中抗原特異性的記憶T細胞的數量。經計算,此HPV自發(fā)清除者(病毒清除后74個月)外周血中抗原特異性的記憶T細胞的頻率約為0.007%。本研究結果為進一步疫苗設計提供重要的理論依據。

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