徐 琳,龔明福,韋革宏＊

(1.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木盆地生物資源保護(hù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,新疆阿拉爾 843300;2.西北農(nóng)林科技大學(xué),陜西楊凌 712100;3.河西學(xué)院生物系,甘肅張掖 734000)

根瘤菌是土壤中廣泛分布的重要微生物類(lèi)群,它與豆科植物的共生是固氮中效能最高的體系。近年來(lái),對(duì)根瘤菌資源和其固氮機(jī)理的研究正在逐步廣泛和深入,新的屬種不斷被發(fā)現(xiàn)[1-3]的同時(shí),也發(fā)掘并保藏了一大批具有優(yōu)秀抗逆品質(zhì)的根瘤菌菌種?？囫R豆廣泛分布于我國(guó)西北地區(qū),其根系發(fā)達(dá),是優(yōu)良的保土固沙植物,由于能與根瘤形成共生體,使得其抗逆能力有效提高。全世界有2種[4]苦馬豆,主要分布于西亞、中亞、東亞、西伯利亞及大洋洲,我國(guó)僅產(chǎn)1種,為苦馬豆(Sphaerophysa salsula),主要分布于我國(guó)西北干旱半干旱地區(qū)。目前對(duì)苦馬豆根瘤菌的研究極少,僅有徐琳等[5]對(duì)苦馬豆根瘤菌進(jìn)行了多樣性和系統(tǒng)發(fā)育研究,而對(duì)其表型多樣性并未進(jìn)行深入研究。本研究擬采用表型性狀測(cè)定及數(shù)值分類(lèi),旨在發(fā)掘一大批具有優(yōu)良性狀的根瘤菌菌株,為豐富我國(guó)根瘤菌菌種資源庫(kù)、探索受損生態(tài)系統(tǒng)恢復(fù)重建及鄉(xiāng)土植物資源生態(tài)產(chǎn)業(yè)化提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 本實(shí)驗(yàn)共選取根瘤菌55株,其中48株未知菌株分別來(lái)自甘肅、寧夏和新疆[5],另外7株為參比菌。未知菌株編號(hào)、宿主和地理來(lái)源見(jiàn)表1。

1.1.2 參比菌株 選取已知參比菌株7株(見(jiàn)表2),與供試菌株同時(shí)測(cè)定生理生化性狀。

表1 供試菌株編號(hào)及來(lái)源Table 1 List of bacterial strains tested and their origins

表2 參比菌株及來(lái)源Table 2 The reference strain and their origins

1.2 方法

1.2.1 性狀分析 實(shí)驗(yàn)共測(cè)定表型性狀113項(xiàng),其中唯一碳源利用24項(xiàng);唯一氮源利用13項(xiàng);抗生素敏感性28項(xiàng);染料抗性測(cè)定14項(xiàng);其他測(cè)定項(xiàng)目有耐鹽性、初始pH、溫度生長(zhǎng)范圍、硝酸鹽還原、耐爾藍(lán)還原、BTB酸堿反應(yīng)、過(guò)氧化氫酶、L-苯丙氨酸脫氫酶測(cè)定尿酶、肉湯生長(zhǎng)等,每個(gè)性狀設(shè)3個(gè)重復(fù)[6]。

1.2.2 聚類(lèi)分析 用NTSYSpc軟件按照平均連鎖法(UPG MA)進(jìn)行聚類(lèi),結(jié)果以樹(shù)狀圖譜方式表示。

1.2.3 表觀群中心菌株的確定 采用最大平均數(shù)法,計(jì)算群內(nèi)菌株的相似性系數(shù),求平均值,平均值最大的即為該表觀群的中心菌株[7]。

2 結(jié)果與分析

2.1 生理生化測(cè)定結(jié)果

2.1.1 唯一碳源的利用 蔗糖、肌醇、L-鼠李糖、葡萄糖、D-果糖、D-甘露糖、海藻糖、麥芽糖可被全部測(cè)試菌株利用;95%菌株可利用D-山梨醇、蜜二糖、L-樹(shù)膠醛糖、半乳糖、乳糖、L-阿拉伯糖;CCNWGS0174、CCNWGS0199、CCNWXJ0221、CCNWXJ0219、CCNWXJ0216、CCNWGS0236、CCNWGS0209、CCNWGS0185、CCNWGS0197、CCNWGS0224這10株菌除L-山梨糖外,其余供試碳源均可利用,說(shuō)明這些菌株的糖酵解底物范圍比較廣泛。結(jié)果表明:大多數(shù)供試菌株能以不同形式的單糖或二糖作為生長(zhǎng)的良好碳源。

2.1.2 唯一氮源的利用 DL-組氨酸不能作為所用供試菌株的唯一氮源,而參比菌株USDA2914、USDA1002、CCBAU71714則可利用DL-組氨酸;L-天冬氨酸、L-正白氨酸、L-苯丙氨酸、L-白氨酸、L-酪氨酸、L-谷氨酸、L-精氨酸可被全部測(cè)試菌株利用;90%菌株可利用L-半胱氨酸、L-胱氨酸、L-甘氨酸、L-賴(lài)氨酸、DL-氨基丙酸作為唯一氮源。參比菌株USDA2914可利用全部供試氮源。

2.1.3 抗生素抗性測(cè)定 所有測(cè)試菌株對(duì)林可霉素(5、50μg/mL)具有抗性,90%測(cè)試菌株對(duì)卡那霉素(5μg/mL)、氯霉素(5μg/mL)、硫酸阿米卡星(5μg/mL)、林可霉素(100、300μg/mL)具有抗性,能在含其濃度抗生素培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng),但隨抗生素濃度的增加菌株的生長(zhǎng)受到不同程度的抑制,當(dāng)鏈霉素濃度增加至300μg/mL、卡那霉素濃度增加至100μg/mL、阿奇霉素濃度增加至50μg/mL、硫酸阿米卡星濃度增加至50μg/mL時(shí),所有測(cè)試菌株的生長(zhǎng)受到抑制。40%菌株能耐高濃度的青霉素(300μg/mL),CCNWGS0174和CCNWXJ0216能耐高濃度的氯霉素(300μg/mL),95%菌株能耐高濃度的林可霉素(300μg/mL)。

2.1.4 對(duì)染料及化學(xué)藥物的耐性測(cè)定 88%菌株對(duì)染料甲基藍(lán)(0.1%、0.2%)、溴百里酚藍(lán)(0.1%、0.2%)、剛果紅(0.1%、0.2%)和中性紅(0.1%)不敏感,能在含其培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng);所有測(cè)試菌株均不能耐受0.2%的亞甲基藍(lán)、0.2%的甲基紅及0.2%的孔雀石綠。除USDA2914、SDW014、USDA3306、SH2672205 4株參比菌株外,其他供試菌株均可在含有0.4%亞硝酸鈉的培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng);僅有4%的菌株不能在含有0.2%去氧膽酸鈉的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。

2.1.5 耐鹽性、初始pH、溫度生長(zhǎng)范圍測(cè)定 除參比菌株SDW014、USDA3306外,全部供試菌株能耐1%的NaCl,80%菌株可以耐2%、3%的NaCl,55%菌株可以耐4%、5%的NaCl,35%菌株可以耐6%的NaCl。全部測(cè)試試菌株在pH 4、pH 5的酸性環(huán)境中不能生長(zhǎng);除參比菌株SDW014、USDA3306、SH2672205外,其余菌株均可在pH 9～12的堿性環(huán)境中生長(zhǎng)。全部測(cè)試菌株在4℃時(shí)不生長(zhǎng);除參比菌株外,其余菌株均可在10℃時(shí)生長(zhǎng);47%菌株在40℃時(shí)可以生長(zhǎng)。將菌株60℃處理30 min、70℃處理10 min后置28℃培養(yǎng),95%菌株可正常生長(zhǎng);而在進(jìn)行60℃處理1 h、70℃處理30 min及70℃處理1 h后,分別有24%、55%菌株及0%的菌株生長(zhǎng)。

2.2 數(shù)值分類(lèi)結(jié)果

從聚類(lèi)圖(圖1)可以看出全部測(cè)試菌株在43.5%的相似水平上聚在一起,未知供試菌株在56%的相似水平上聚在一起。所有未知菌株在72%的相似水平上分為5個(gè)群。群Ⅰ有39株菌,在74.6%相似水平聚合,中心菌株為CCNWGS0215;群Ⅱ有5株菌,在76%相似水平聚合,中心菌株為CCNWGS0228;群Ⅳ包括了CCNW0172和CCNW0173 2株菌,在81.5%的相似水平上聚合;群Ⅲ和V群分別有1株菌,在68.5%和56.5%的相似水平上與其他供試菌株明顯區(qū)分。

圖1 數(shù)值分類(lèi)樹(shù)狀圖Fig.1 Dendrogram of the rhizobial strains in numerical taxonomy

2.3 各類(lèi)群之間的鑒別特征

表3 各類(lèi)群之間的鑒別特征Table 3 Characteristics of identification among clusters

從表3各類(lèi)群的鑒別特征統(tǒng)計(jì)結(jié)果可以看出:第Ⅲ、Ⅳ類(lèi)群的菌株幾乎對(duì)糖原和D-木糖均不能利用,而第Ⅰ、Ⅱ類(lèi)群有80%以上的菌能夠利用它們作為唯一碳氮源;第Ⅰ類(lèi)群的菌株對(duì)青霉素不敏感,而其他3個(gè)群的菌株對(duì)其敏感。第Ⅳ類(lèi)群的菌株對(duì)氯化鈉(6%),中性紅(0.2%),青霉素(300 mg/mL)及氯霉素(50μg/mL)的耐受性較低,而群Ⅰ對(duì)這些指標(biāo)的耐受度較高。這些鑒別特征是它們獨(dú)立成群的主要依據(jù)。

3 討 論

生理生化測(cè)定結(jié)果表明,供試的48株根瘤菌絕大多數(shù)菌株能利用不同形式的單糖或二糖作為生長(zhǎng)的良好碳源,對(duì)供試抗生素及染料有較好的抗性,所有的菌株均具有較強(qiáng)的耐鹽堿能力,全部未知菌株均可耐受pH 12的強(qiáng)堿性環(huán)境。Janet[8]和Mohammad等[9]認(rèn)為,根瘤菌在抗干旱和抗鹽堿方面具有相關(guān)性,陳利云等[10]研究表明,抗旱性強(qiáng)的根瘤菌耐鹽堿能力也較強(qiáng)。供試菌株所體現(xiàn)出的性狀與其寄主植物的生存環(huán)境密切相關(guān),植物采樣地為西北干旱半干旱區(qū),氣候?yàn)榇箨懟哪畾夂騾^(qū),絕大部分樣區(qū)位于鹽堿地或荒漠地,與它們所共生的根瘤菌所具有的特殊生理性狀是其在長(zhǎng)期逆境脅迫下,經(jīng)過(guò)雙重選擇,逐漸進(jìn)化、適應(yīng)生態(tài)環(huán)境的結(jié)果。

通過(guò)對(duì)數(shù)值分類(lèi)的分析表明,全部未知供試菌株在72%的相似水平上分為5個(gè)表觀群,顯示了供試菌株豐富的表型多樣性。除USDA 2914、USDA 1002及CCBAU71714可與類(lèi)群Ⅰ在77%的相似水平上聚群外,其他參比菌株與未知菌株的相似性都較低,表明供試菌株與參比菌株差別較大。未知菌株均為革蘭陰性,無(wú)芽胞,多數(shù)菌株可利用D-木糖、乳糖、丙酸鈉、L-阿拉伯糖、D-果糖、蜜三糖、鼠李糖、甘露糖、有機(jī)酸、檸檬酸鹽、醋酸鈉、葡萄糖、蔗糖、乳糖、酒石酸鈉和肌醇,但不能以D-山梨醇為唯一碳源?？衫肔-胱氨酸、甲硫氨酸、L-丙氨酸、谷氨酸、蘇氨酸、白氨酸、精氨酸及腺嘌呤作為唯一氮源。最佳生長(zhǎng)溫度為28℃,溫度60℃以上時(shí)生長(zhǎng)受到抑制,最適pH為7～10。對(duì)0.1%甲基綠、5μg/mL阿奇霉素、50 μg/mL卡那霉素和50μg/mL阿米卡星敏感。是否屬于潛在的新種,需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

從聚類(lèi)圖還可以得出:同一地理來(lái)源的菌株具較高的相似性,并聚到同一個(gè)類(lèi)群,如群Ⅳ的CCNWNX0172和CCNWNX0173 2株菌均來(lái)源于寧夏銀川,它們的相似性達(dá)95%。不同地理來(lái)源的菌株具較高的相似性,可以聚到同一個(gè)類(lèi)群,如群Ⅰ的28株菌中包括了分離自新疆的4株菌株和來(lái)源于甘肅省張掖市的24株菌,它們?cè)?2%相似性水平上聚群。上述現(xiàn)象表明,根瘤菌與豆科植物之間的共生結(jié)瘤關(guān)系受到地理來(lái)源和生態(tài)環(huán)境的影響,這一結(jié)果與陳文新等[11]的觀點(diǎn)一致。

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