李國輝,唐 琦,胡朝陽,陳慧卿

(江蘇大學(xué)生命科學(xué)研究院,江蘇鎮(zhèn)江 212013)

家蠶核型多角體病毒(B om byx m orinucleopolyhedrovirus,BmNPV)是昆蟲桿狀病毒科核多角體病毒屬的代表成員,該病毒是具有囊膜包被的雙鏈環(huán)狀DNA病毒,其基因組為128 kb,理論預(yù)計(jì)有136個(gè)開放閱讀框(編碼具有60個(gè)氨基酸以上的ORF,Open readingframe)[1]。研究報(bào)道BmNPV宿主范圍域較窄,主要感染家蠶卵巢組織來源的BmN細(xì)胞系,而不能在草地貪葉蛾卵巢組織來源的Sf21或者Sf9細(xì)胞系以及粉紋夜蛾胚胎來源的Hi5細(xì)胞系中有效地增殖[2-3]。BmNPV在其生活史中會出現(xiàn)2種典型的病毒粒子:出芽型病毒粒子BV和包埋型病毒粒子ODV。ODV病毒粒子介導(dǎo)家蠶個(gè)體之間的傳播;而BV病毒粒子介導(dǎo)家蠶體內(nèi)細(xì)胞以及體外培養(yǎng)細(xì)胞之間的傳播。BV與ODV在遺傳組成上相同,它們表型不同主要體現(xiàn)在病毒囊膜蛋白組分上的差異,其中GP64蛋白是BV病毒粒子囊膜上的一種特有結(jié)構(gòu)蛋白[4-5]。GP64蛋白是病毒囊膜上的一個(gè)糖蛋白,在病毒感染宿主的過程中,該蛋白能夠介導(dǎo)pH引發(fā)的病毒與宿主之間的膜融合;GP64蛋白對于病毒粒子的出芽和感染性病毒粒子的產(chǎn)生也是必需的;近來研究表明該蛋白與宿主細(xì)胞膜上的受體結(jié)合區(qū)主要定位在GP64蛋白的N端[5-7]。GP64蛋白也是Ⅰ型NPV與Ⅱ型NPV之間的一個(gè)分類依據(jù),盡管Ⅱ型NPV中不存在GP64的同源蛋白,但在Ⅱ型NPV中存在與GP64蛋白功能類似蛋白[8-10]。GP64(BmNPV ORF105)基因是Ⅰ型NPV中的一個(gè)高度保守基因,其中BmNPV GP64蛋白與苜蓿丫蚊夜蛾核多角體病毒(AcMNPV)GP64蛋白一致性高達(dá)95%;GP64基因位于BmNPV基因組99 844～101 436 nt之間,閱讀框全長1 593 bp,編碼530個(gè)氨基酸,預(yù)計(jì)分子量64 ku,故命名為GP64蛋白[1,11]。為了深入研究BmNPVGP64基因在病毒感染過程中的具體功能,通過PCR擴(kuò)增BmNPVGP64基因中的904 bp DNA片段,其編碼的蛋白理論分子量大小為34 ku,通過原核表達(dá)系統(tǒng)成功地表達(dá)了BmNPV GP64截短蛋白,對表達(dá)的目的蛋白進(jìn)行割膠純化并免疫昆明小鼠,進(jìn)而獲得了GP64多克隆抗體,為深入研究BmNPV GP64蛋白在病毒侵染過程中的具體功能以及為病毒基因組其他基因的功能研究提供了依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料 BmN細(xì)胞、野生型BmNPV、克隆菌株大腸埃希菌(Escherichia coli)DH5α和表達(dá)菌株BL21(DE3)由本室保存;原核表達(dá)載體pET-28a質(zhì)粒購于Novagen公司。雄性昆明小鼠購自江蘇大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

1.1.2 培養(yǎng)基 大腸埃希菌的培養(yǎng)采用常規(guī)固體或液體LB培養(yǎng)基;BmN細(xì)胞培養(yǎng)于TC-100培養(yǎng)基(AppliChem)輔以10%胎牛血清(Gibco BRL)。

1.1.3 主要試劑 限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、HindⅢ、250 bp DNA LadderMarker、蛋白質(zhì)低分子量Marker、Taq酶購自TaKaRa公司;蛋白質(zhì)預(yù)染MarkerⅢ購自Fer mentas公司;質(zhì)粒提取和膠回收試劑盒購自O(shè)mega公司;丙烯酰胺和N,N-亞甲基雙丙烯酰胺購自Promega公司;Anti-His單抗購自Invitrogen公司;HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗購自武漢博士德公司;DAB底物顯色試劑盒購自北京康為世紀(jì)生物公司;弗氏完全佐劑和不完全佐劑購自Sigma公司。

1.1.4 儀器 PCR儀(Applied Biosystems,Eppendorf);GelDoc 2000凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司);聚丙烯酰胺凝膠電泳與蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1 BmNPV基因組DNA的提取 BmNPV基因組DNA純化參照文獻(xiàn)[12]。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)及PCR 參照BmNPV基因組全序列[1],通過Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)2條特異性引物:GP64-F:5′-AT GAATTCAATCAGTCA TACCAAGGCTTCGA和GP64-R:5′-GCAAGCTTC CAAGTGGGGTGGCCG-3′,引物2端分別引入了EcoRⅠ和HindⅢ酶切位點(diǎn)。以提取的BmNPV Bacmid為模板,用引物GP64-F和GP64-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增的目的片段理論大小為904 bp,反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性4 min,94℃變性40 s、55℃退火40 s、72℃延伸40 s,32個(gè)循環(huán),最后72℃延伸10 min,于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 GP64截短蛋白的表達(dá)載體構(gòu)建 將GP64-F和GP64-R引物對擴(kuò)增的DNA片段進(jìn)行EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切,對酶切純化后的DNA片段與經(jīng)同樣雙酶切的原核表達(dá)載體pET28a進(jìn)行連接,將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞,對平板上的克隆進(jìn)行鑒定,對目的重組質(zhì)粒命名為pET28a-GP64。膠回收按照試劑盒操作說明進(jìn)行;質(zhì)粒提取、酶切、連接、轉(zhuǎn)化等步驟參照文獻(xiàn)[13]進(jìn)行。

1.2.4 GP64截短蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和多克隆抗體的制備 將重組質(zhì)粒pET28a-GP64轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞。挑取鑒定正確的目的克隆接種于3 mL LB培養(yǎng)基中,37℃搖床培養(yǎng)過夜,次日按1◇100轉(zhuǎn)接,至OD600為0.5時(shí),直接向菌液中加入不同濃度的IPTG(0、0.5、0.8、1.0 mmol/L)誘導(dǎo)目的蛋白的表達(dá),6 h后收集誘導(dǎo)后的菌液并進(jìn)行處理,對處理后的菌液進(jìn)行12%的

SDS-PAGE分析與免疫印跡檢測。采用割膠純化的方法直接從SDS-PAGE膠上割取鑒定后的目的蛋白帶,對蛋白膠條進(jìn)行PBS洗滌過夜,將小膠塊與適量的PBS研磨成勻漿液,總體積不超過2 mL。將研磨的勻漿液與等體積的弗氏佐劑乳化后對昆明小鼠進(jìn)行皮下多點(diǎn)免疫,注射間隔周期為10 d,加強(qiáng)注射所用的抗原溶液用弗氏不完全佐劑進(jìn)行乳化。第3次免疫注射后,剪鼠尾采血,測定血清效價(jià),當(dāng)效價(jià)達(dá)到1◇1 000以上時(shí),血清即可使用。

1.2.5 GP64抗體的檢測 用制備的GP64多抗

(1◇1 000)與BmNPV感染72 h的BmN細(xì)胞總蛋白進(jìn)行Western Blot分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組質(zhì)粒pET28a-GP64的構(gòu)建

圖1 重組質(zhì)粒pET28a-GP64的酶切鑒定Fig.1 Restriction analysis of the recombinant plas mid of pET28a-GP64

以抽提的BmNPV Bacmid為模板,以設(shè)計(jì)的特異引物對GP64-F/GP64-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增,得到1條大小為904 bp的DNA特異擴(kuò)增片段,對回收后的該P(yáng)CR產(chǎn)物進(jìn)行EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切,將純化后的雙酶切DNA片段與經(jīng)同樣雙酶切后純化后的pET28a載體進(jìn)行連接,將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞,對平板上的克隆進(jìn)行

PCR擴(kuò)增并提取重組質(zhì)粒進(jìn)行EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定。對鑒定后的重組質(zhì)粒pET28a-GP64進(jìn)行DNA測序,對測序后的目的序列與NCB I網(wǎng)上公布的序列進(jìn)行Blast比對,比對結(jié)果表明GP64基因來源的904 bp DNA片段已正確連接到pET28a載體上。

2.2 GP64截短蛋白在E.coli中的表達(dá)

圖2 GP64截短蛋白在大腸埃希菌BL21(DE3)中的表達(dá)和W estern Blot分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of GP64 expressed in BL21(DE3)and Western Blot analysis

將構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET28a-GP64轉(zhuǎn)入宿主表達(dá)菌BL21(DE3)后,往菌液中添加不同濃度的IPTG誘導(dǎo)目的蛋白的表達(dá),6 h后收集誘導(dǎo)后的菌體并對其進(jìn)行SDS-PAGE分析,結(jié)果表明,在40 ku的位置出現(xiàn)1條很明顯的誘導(dǎo)蛋白帶,比預(yù)期大小略大(圖2A lane3～5);而空白對照(圖2A lane1)以及沒有進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)的克隆菌株(圖2A lane2)在相應(yīng)的位置處都沒有誘導(dǎo)蛋白帶。通過Anti-His的單抗對誘導(dǎo)蛋白帶N-端融合的6×His標(biāo)簽進(jìn)行Western Blot檢測,顯色后的雜交膜僅在誘導(dǎo)蛋白帶位置處出現(xiàn)一陽性雜交信號(圖2B lane2),表明GP64截短蛋白成功地獲得了融合表達(dá)。

2.3 GP64截短蛋白抗體的制備與檢測

對原核表達(dá)的GP64截短蛋白進(jìn)行割膠純化,并將其與佐劑乳化后對雄性昆明小鼠進(jìn)行免疫,待3次加強(qiáng)免疫后收集抗血清。將制備的GP64多抗對BmNPV感染72 h的BmN細(xì)胞總蛋白進(jìn)行Western Blot印跡分析,顯色后的雜交膜在約64 ku的位置出現(xiàn)1條特異雜交帶,而未感染病毒的BmN細(xì)胞總蛋白中沒有雜交到陽性信號,該結(jié)果與理論預(yù)計(jì)的相一致。

圖3 GP64蛋白抗體在病毒感染的細(xì)胞中的檢測Fig.3 Western Blot analysis of GP64 in BmNPV-infected BmN cells using GP64 antiserum

3 討 論

GP64是核型多角體病毒囊膜上的一個(gè)蛋白,研究表明該蛋白是一個(gè)糖基化修飾的蛋白,在病毒入侵宿主細(xì)胞以及出芽型病毒轉(zhuǎn)運(yùn)過程中都起重要作用。對于深入研究BmNPV GP64蛋白在病毒感染宿主過程中的具體作用以及鑒定其互作蛋白而言,制備高效價(jià)的GP64蛋白抗體是一種有效的方法。曾對GP64基因的完整讀碼框進(jìn)行擴(kuò)增,并將構(gòu)建的能表達(dá)GP64的原核表達(dá)載體導(dǎo)入BL21(DE3)宿主表達(dá)菌,盡管多次對誘導(dǎo)表達(dá)條件進(jìn)行摸索,仍沒能獲得原核表達(dá)的GP64蛋白(結(jié)果未顯示)。通過www.gcua.de在線軟件對GP64基因讀碼框在大腸埃希菌中的使用頻率進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)該基因序列中稀有密碼子比例較高,尤其是起始密碼子ATG后的2個(gè)密碼子使用頻率只有16%(結(jié)果未顯示)。

鑒于以上原因,選擇性地對BmNPVGP64基因讀碼框的部分片段進(jìn)行擴(kuò)增,擴(kuò)增的DNA片段所編碼的氨基酸序列與原理論編碼序列相一致。將所擴(kuò)增的DNA片段進(jìn)行酶切回收,對回收純化后的DNA與原核表達(dá)載體pET28a進(jìn)行連接,對酶切鑒定后的重組克隆進(jìn)行測序分析,其序列結(jié)果與GenBank中登錄的序列對應(yīng)部分完全一致。對捕獲了重組質(zhì)粒的BL21(DE3)大腸埃希菌進(jìn)行IPTG誘導(dǎo),對誘導(dǎo)后的菌體進(jìn)行SDS-PGAE分析,其結(jié)果表明原核細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)了GP64截短蛋白的融合表達(dá),通過Anti-His標(biāo)簽的單克隆抗體對誘導(dǎo)蛋白帶進(jìn)行免疫印跡分析,結(jié)果進(jìn)一步證明了GP64截短蛋白的表達(dá)。由于表達(dá)的GP64截短蛋白的N-端融合有6×His接頭以及載體上的部分序列,故表達(dá)的GP64截短蛋白實(shí)際分子量比理論蛋白分子量34 ku稍大。通過從膠上直接割取目的蛋白帶,以混有等量佐劑的研磨液直接對雄性昆明小鼠進(jìn)行皮下多點(diǎn)注射,獲得GP64蛋白的多克隆抗體。以制備的GP64多克隆抗體與BmNPV感染的細(xì)胞總蛋白進(jìn)行雜交,能檢測到1條64 ku左右的特異雜交帶,而對照細(xì)胞中沒有出現(xiàn)相應(yīng)的帶,該結(jié)果表明所制備的GP64抗體是可用的。

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