萬 菡 ,何麗萍,劉良忠,李丁寧,劉培勇

(武漢工業(yè)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院,湖北武漢 430023)

我國(guó)是世界第一水產(chǎn)品產(chǎn)量、水產(chǎn)養(yǎng)殖和水產(chǎn)品貿(mào)易大國(guó)。目前,我國(guó)水產(chǎn)品產(chǎn)量約占世界總產(chǎn)量的 38%,養(yǎng)殖水產(chǎn)品產(chǎn)量占世界養(yǎng)殖水產(chǎn)品總量的 70%,水產(chǎn)品產(chǎn)量連續(xù) 16年居世界第一位。湖北是我國(guó)淡水漁業(yè)發(fā)展最快、產(chǎn)量最高的省份,淡水產(chǎn)品總量及人均占有量連續(xù)多年保持全國(guó)第一位。2008年全省加工企業(yè) 206家,加工能力 75萬 t,加工量 44.7萬 t,加工量占水產(chǎn)總量的 12.6%;隨著淡水魚產(chǎn)量的增加和淡水魚加工的迅速發(fā)展,大量的淡水魚加工廢棄物有待處理[1]。以白鰱和草魚為例,在加工的過程中會(huì)產(chǎn)生大量的下腳料,其重量約占原料魚的 40%—55%。其中,白鰱魚內(nèi)臟占體重 10%—15%;草魚內(nèi)臟占體重 15%—20%。目前,淡水魚內(nèi)臟沒有得到合理有效的利用,這不僅造成了資源的浪費(fèi),而且污染了環(huán)境。

淡水魚內(nèi)臟含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),包括蛋白質(zhì)、油脂、磷脂質(zhì)、軟骨素、胰島素、黏多糖、VA、VD等[2-3]。其中,鰱魚、草魚、鳙魚內(nèi)臟粗蛋白的含量分別達(dá)到了 5.5%—10.5%、6.7%—9.9%、15.6%—17.9%。

蛋白質(zhì)的功能特性是指能使蛋白質(zhì)對(duì)食品優(yōu)良特性作出貢獻(xiàn)的性質(zhì)。蛋白水解產(chǎn)物功能特性有溶解度、粘度、乳化性、起泡性、凝膠性和風(fēng)味特性等,它們很大程度上取決于蛋白質(zhì)的分子大小或水解度。蛋白質(zhì)水解物的功能特性也受蛋白質(zhì)水解所用的酶、完全蛋白質(zhì)的物理、化學(xué)本質(zhì)和水解條件的影響,如酶解能大大提高其溶解性;一定程度的水解液能提高其乳化性等。本文從對(duì)制備得到三種草魚內(nèi)臟水解蛋白質(zhì)功能性質(zhì)進(jìn)行測(cè)定,并通過不同培養(yǎng)基培養(yǎng)枯草芽孢桿菌和大腸桿菌,優(yōu)選出最適微生物培養(yǎng)基的草魚內(nèi)臟水解蛋白。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 材料

提取魚油后的草魚內(nèi)臟;堿性蛋白酶 (Alcalase,20×104U/g)：廣西南寧龐博生物工程有限公司;市售商品蛋白胨;供試枯草芽胞桿菌和大腸桿菌菌種：武漢工業(yè)學(xué)院生物與制藥工程學(xué)院生物實(shí)驗(yàn)室提供;氫氧化鈉,鹽酸,氫氧化鉀,酒石酸鉀鈉,硫酸銅等均為分析純。

1.1.2 培養(yǎng)基

共 4種蛋白胨樣品,分別為：草魚內(nèi)臟蛋白水解液凍干樣 (1號(hào)樣)、草魚內(nèi)臟蛋白水解液脫色脫腥脫脂后凍干樣 (2號(hào)樣)、草魚內(nèi)臟蛋白水解液脫色脫腥后凍干樣 (3號(hào)樣)和市售商品蛋白胨 (4號(hào)樣)。

9種培養(yǎng)基,分別為：

①1號(hào)樣 0.1%;

②2號(hào)樣 0.1%;

③3號(hào)樣 0.1%

④4號(hào)樣 0.1%;

⑤1號(hào)樣 0.3%,NaCl 0.1%,葡萄糖 0.5%;

⑥2號(hào)樣 0.3%,NaCl 0.1%,葡萄糖 0.5%;

⑦3號(hào)樣 0.3%,NaCl 0.1%,葡萄糖 0.5%;

⑧4號(hào)樣 0.3%,NaCl 0.1%,葡萄糖 0.5%;

⑨牛肉膏固體培養(yǎng)基：4號(hào)樣 1%,NaCl 0.5%,牛肉膏 0.3%,瓊脂 2%。

1.2 方法

1.2.1 三種草魚內(nèi)臟水解蛋白的制備

取提油后的草魚內(nèi)臟,按內(nèi)臟：水 =1∶2放入組織搗碎機(jī)中搗碎,混合均勻,調(diào)節(jié) pH=9,加入酶量為 65u/g的堿性蛋白酶,在溫度為 47.5℃的酶反應(yīng)器中水解 2.2h,100℃滅酶 10min,4000r/min離心20min,棄去上層油脂和下層不溶物,即得到草魚內(nèi)臟蛋白水解液。用 2%的酵母粉在 32℃條件下保溫時(shí)間 1 h,再用 1mol/L的鹽酸調(diào)節(jié)水解液的 pH3,加入 1.0%的粉狀活性炭在溫度 60℃條件下脫色80min,兩層濾紙抽濾,得到脫色脫腥后的草魚內(nèi)臟蛋白水解液。再加入 2%的乙醚搖勻,靜置 1 h分層后去乙醚層即得脫色脫腥去脂后的草魚內(nèi)臟蛋白水解液。將此三種水解液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮后置于-40℃冰箱中過夜,移至冷凍干燥機(jī)冷凍干燥,得到三種水解物,分別為：草魚內(nèi)臟蛋白水解液凍干樣(1號(hào)樣)、草魚內(nèi)臟蛋白水解液脫色脫腥脫脂后凍干樣 (2號(hào)樣)、草魚內(nèi)臟蛋白水解液脫色脫腥后凍干樣 (3號(hào)樣)。

1.2.2 水溶性指數(shù) (NSI)的測(cè)定

用文獻(xiàn)[4]的方法測(cè)定。

1.2.3 乳化性與乳化穩(wěn)定性的測(cè)定

稱取一定量的凍干樣溶于 50mL蒸餾水中,調(diào)解 pH到一定值,加入 50mL大豆色拉油,在高速組織搗碎機(jī)中均質(zhì) (10000—12000 r/min)2min,再1500 r/min離心 5min。按下式計(jì)算乳化能力：

將上述離心管置于 80℃水浴中,加熱 30min后,冷卻至室溫,在離心 (1500 r/min)5min,測(cè)出此時(shí)的乳化層高度,則乳化穩(wěn)定性為：

在不同濃度的凍干樣 (1%、3%、5%)分別調(diào)節(jié)不同 pH(3,5,7,9)測(cè)定其乳化性和乳化穩(wěn)定性[5-6]。

1.2.4 起泡性和泡沫穩(wěn)定性的測(cè)定

將一定量的凍干樣溶解到 100mL蒸餾水中,調(diào)節(jié) pH到一定值,在高速組織搗碎機(jī)中均質(zhì) (10000～12000 r/min)2min,記下均質(zhì)停止時(shí)泡沫體積,則起泡性為：

均質(zhì)停止 30min后,記下此時(shí)泡沫體積,則泡沫穩(wěn)定性為：

不同濃度的凍干樣 (1%,3%,5%)分別調(diào)節(jié)不同 pH(3,5,7,9)測(cè)定起泡性。

1.2.5 吸油性的測(cè)定

準(zhǔn)確稱量 0.5 g樣品于離心管中,加入 3mL大豆色拉油,充分混合 1min,靜止 30min,離心沉降(1000 r/min)25min,吸取上層未吸附油,稱重。

注 ：W ：樣品重量 (g);

W1：吸油前樣品和離心管總重量 (g);

W2：吸油后樣品和離心管總重量 (g)。

分別在不同溫度 (30℃,50℃,70℃,90℃)下測(cè)定 1g樣品吸取油的質(zhì)量 (g)。

1.2.6 培養(yǎng)基及試驗(yàn)用品的滅菌方法

配制①號(hào)培養(yǎng)基 360mL,平均分裝在 36只試管中;配置牛肉膏固體培養(yǎng)基 500mL。將上述 2種培養(yǎng)基和若干試管、小燒杯、移液管和移液槍槍頭等置于高壓滅菌鍋中,121℃濕熱滅菌 30min,然后在超凈工作臺(tái)上,趁熱將部分固體培養(yǎng)基分裝于 4支已滅菌的大試管中,并且制成斜面。將所有分裝好的培養(yǎng)基、斜面置于 37℃恒溫培養(yǎng)箱中,作無菌檢測(cè)試驗(yàn)。無污染的斜面用于活化菌種,液體培養(yǎng)基用于分組試驗(yàn)。

1.2.7 液體培養(yǎng)基分組 (以①號(hào)培養(yǎng)基為例)

將裝有①號(hào)培養(yǎng)基的 36支試管分成 3組：A組為枯草芽胞桿菌組,B組為大腸桿菌組,C組為空白組。向每支試管中接入已活化的對(duì)應(yīng)菌液 0.1mL,適當(dāng)振蕩混勻。每組重復(fù) 3次。

1.2.8 OD420值的測(cè)定和微生物培養(yǎng)

將菌種接入各培養(yǎng)液后即進(jìn)行第 1次 OD420值的測(cè)定,測(cè)定后將試管置于 37℃恒溫培養(yǎng)搖床中培養(yǎng),每隔 2 h測(cè)定并記錄 OD420值 1次。在測(cè)定過程中,應(yīng)盡量減少培養(yǎng)液在空氣中暴露的時(shí)間,在每次吸取液體后應(yīng)更換所用槍頭和移液管,在吸取前應(yīng)適當(dāng)振蕩試管中的液體。每次測(cè)定完畢,用液體培養(yǎng)基涮洗比色皿 3次。每次讀出的 OD420值最好不超過 0.4,超出時(shí),應(yīng)進(jìn)行適當(dāng)稀釋并重新測(cè)定,測(cè)定的OD值乘以稀釋倍數(shù)后即為實(shí)際的OD值。

1.2.9 繪制細(xì)菌生長(zhǎng)曲線

根據(jù) 3次重復(fù)測(cè)定所得的數(shù)據(jù)求出 OD420平均值,然后以 OD420值為縱坐標(biāo),時(shí)間為橫坐標(biāo)分別繪出生長(zhǎng)曲線。

2 結(jié)果與討論

2.1 水溶性指數(shù)

不同水溶性蛋白的溶解性試驗(yàn)結(jié)果見表1。從表可知,不同水溶性蛋白在不同 pH值下的溶解度不同,三種樣品均在 pH4—5時(shí)溶解度最小,這可能是因?yàn)椴蒴~內(nèi)臟蛋白的等電點(diǎn)在此范圍內(nèi)。比較這三種凍干樣,可以看出,1號(hào)樣在 pH4—5時(shí)的溶解度比 2、3號(hào)樣小,這可能是由于在脫色脫腥時(shí)選用的粒狀活性碳將大分子的蛋白吸附,剩下較小的蛋白分子在此 pH值下不易出現(xiàn)沉淀。

表1 不同水溶性蛋白濃度、pH值下的水溶性指數(shù)

2.2 乳化性及乳化穩(wěn)定性

蛋白質(zhì)是一種表面活性劑,它不僅能降低油和水的表面張力,使之易于乳化,而且蛋白質(zhì)分散在非連續(xù)向何連續(xù)相之間的界面上,阻止非連續(xù)相的聚集,起到穩(wěn)定乳狀液的作用。不同水溶性蛋白在不同蛋白濃度和 pH值下的乳化性和乳化穩(wěn)定性見圖1、和 2。

圖1 不同水溶蛋白濃度、pH值對(duì)乳化性的影響

如圖1所示,這三種水溶蛋白在接近蛋白等電點(diǎn) pH5時(shí)乳化性最低,偏離這個(gè)等電區(qū)域,在等電點(diǎn)左邊的 pH區(qū)域,乳化性隨著 pH值升高而降低;在其右邊的 pH區(qū)域內(nèi),乳化性隨 pH值升高而升高。另外,隨著水溶蛋白濃度的升高,其乳化性升高。其中 3號(hào)樣的乳化性最好,在樣品濃度為 5%,pH9時(shí)其乳化性為 73%。這可能是因?yàn)槠渌苄院?且經(jīng)脫腥脫色后的蛋白分子較小,分散性好,有效降低油和水的表面張力,從而促進(jìn)形成油-水性乳狀液的能力。

圖2 不同水溶蛋白濃度、pH值對(duì)乳化穩(wěn)定性的影響

如圖2所示,三種水溶蛋白在接近蛋白等電點(diǎn)pH=5時(shí)乳化穩(wěn)定性最高,偏離這個(gè)等電區(qū)域,在等電點(diǎn)左邊的 pH區(qū)域,乳化性隨著 pH值升高而升高,且幅度較大;在其右邊的 pH區(qū)域內(nèi),乳化性隨pH值升高而降低,降低幅度較小。另外,隨著水溶蛋白濃度的升高,其乳化穩(wěn)定性增強(qiáng)。其中,3號(hào)樣的乳化性穩(wěn)定性最好,當(dāng)樣品濃度 5%,pH5時(shí),其乳化穩(wěn)定性為 75.9%。這可能是因?yàn)槠渌苄宰詈?且經(jīng)脫腥脫色后的蛋白分子較小,有助于界面膜流變性質(zhì)的改善,使之維持乳狀液穩(wěn)定存在的能力增強(qiáng)。

2.3 起泡性及泡沫穩(wěn)定性

蛋白具有一定的氣泡性,這是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)能降低氣-液界面的表面張力而幫助形成氣泡。不同水溶性蛋白在不同蛋白濃度和 pH值下的起泡性和泡沫穩(wěn)定性見圖3和圖4。

圖3 不同水溶蛋白濃度、pH值對(duì)起泡性的影響

如圖3所示,三種水溶蛋白在接近蛋白等電點(diǎn)pH=5時(shí)起泡性最低,偏離這個(gè)等電區(qū)域,在等電點(diǎn)左邊的 pH區(qū)域,起泡性隨著 pH值升高而降低;在其右邊的 pH區(qū)域內(nèi),起泡性隨 pH值升高而升高。

三種水溶蛋白在濃度為 3%時(shí)起泡性最高。蛋白濃度小于 3%時(shí)起泡性隨著蛋白質(zhì)濃度的升高而升高,超過 3%時(shí)起泡性隨著蛋白濃度的升高而降低。其原因可能是蛋白質(zhì)濃度過高時(shí),擴(kuò)散速度快,拉伸形成的新界面能迅速得到蛋白質(zhì)的覆蓋,即“吉布斯·戈蘭高內(nèi)效應(yīng)”減弱泡沫粗化,穩(wěn)定性降低[7]。

3號(hào)樣在不同濃度下 (1%,3%,5%)的起泡性均最好,這可能是由于蛋白質(zhì)分子越小,溶液的粘度越低,低表面張力對(duì)泡沫的形成比較有利。由圖可知濃度為 3%的 3號(hào)樣的起泡性最高,在 pH9條件下其起泡性為 162.8%。

圖4 不同水溶蛋白濃度、pH值對(duì)起泡穩(wěn)定性的影響

如圖4所示,三種水溶蛋白在接近蛋白等電點(diǎn)pH=5時(shí)泡沫穩(wěn)定性最高,偏離這個(gè)等電區(qū)域,在等電點(diǎn)左邊的 pH區(qū)域,泡沫穩(wěn)定性隨著 pH值升高而升高;在其右邊的 pH區(qū)域內(nèi),泡沫穩(wěn)定性隨 pH值升高而降低,這是因?yàn)樵诘入妳^(qū)域泡沫破裂非常緩慢,泡沫破裂和 pH值有很大關(guān)系,在等電點(diǎn)區(qū)域,泡沫破裂減慢,因此泡沫穩(wěn)定。1號(hào)樣在不同濃度下 (1%,3%,5%)的泡沫穩(wěn)定性均最好,這可能是由于決定泡沫穩(wěn)定性的關(guān)鍵因素在于液膜的強(qiáng)度,而液膜強(qiáng)度主要決定于表面吸附膜的堅(jiān)固性,液膜粘度大可以增加膜強(qiáng)度,而 2、3號(hào)樣的粘度較低,液膜強(qiáng)度小,故泡沫穩(wěn)定性比 1號(hào)樣差。由圖可知濃度為 5%的 1號(hào)樣的泡沫穩(wěn)定性最高,在 pH 5條件下其泡沫穩(wěn)定性為 94.1%。

2.4 吸油性

不同水溶性蛋白在不同溫度下的吸油性見圖5。

圖5 不同水溶性蛋白的吸油性(g/g)

由圖5可以看出,2號(hào)樣的吸油性最好,在 90℃條件下其吸油性為 1.242g/g,這可能是由于 2號(hào)樣經(jīng)過了脫脂處理,樣品中含的油脂最少。

2.5 不同單一草魚內(nèi)臟水解蛋白對(duì)枯草芽胞桿菌和大腸桿菌的生長(zhǎng)曲線

生長(zhǎng)曲線法可通過生長(zhǎng)曲線反映微生物的群體生長(zhǎng)規(guī)律,并從中探知微生物對(duì)環(huán)境的適應(yīng)快慢程度、微生物對(duì)培養(yǎng)基成分的利用情況、藥物中不同成分對(duì)微生物產(chǎn)生的不同作用以及藥效最強(qiáng)和最弱的時(shí)間等多種有意義的信息。

圖6 不同單一蛋白胨下枯草芽胞桿菌的生長(zhǎng)曲線

圖7 不同單一蛋白胨下大腸桿菌的生長(zhǎng)曲線

本試驗(yàn)通過生長(zhǎng)曲線了解微生物對(duì)培養(yǎng)基成分的利用情況。單一草魚內(nèi)臟水解蛋白為培養(yǎng)基試驗(yàn)測(cè)得枯草芽胞桿菌的生長(zhǎng)曲線見圖6。通過測(cè)定吸光度反映細(xì)菌生長(zhǎng)情況。在 0 h時(shí)的 OD值是培養(yǎng)基和起始菌液兩者吸光度的總和。從圖6中可以看出,生長(zhǎng)在②和③培養(yǎng)基中的枯草芽胞桿菌生長(zhǎng)迅速,比④培養(yǎng)基中培養(yǎng)效果好,①效果最差。這可能是因?yàn)?1號(hào)樣未經(jīng)過脫色脫腥處理,其水解液中含有一些成分不利于細(xì)菌的生長(zhǎng)。

單一草魚內(nèi)臟水解蛋白為培養(yǎng)基試驗(yàn)測(cè)得大腸桿菌的生長(zhǎng)曲線見圖7。從圖7中可以看出,生長(zhǎng)在②和③培養(yǎng)基中的大腸桿菌生長(zhǎng)迅速,比④培養(yǎng)基中培養(yǎng)效果好,①效果最差。這可能是因?yàn)棰傥唇?jīng)過脫色脫腥處理,其水解液中含有其它物質(zhì)等不利于細(xì)菌的生長(zhǎng)。從圖1和圖2可以看出,革蘭氏陽性菌 (枯草芽胞桿菌)和革蘭氏陰性菌 (大腸桿菌)在②和③培養(yǎng)基中生長(zhǎng)迅速,可以作為很好的微生物培養(yǎng)用蛋白胨。

2.6 不同草魚內(nèi)臟水解蛋白為氮源的培養(yǎng)基中枯草芽孢桿菌和大腸桿菌的生長(zhǎng)曲線

在以草魚內(nèi)臟水解蛋白為氮源,加入鹽分和糖分的培養(yǎng)基試驗(yàn),測(cè)得枯草芽胞桿菌的生長(zhǎng)曲線見圖8;不同培養(yǎng)基中大腸桿菌的生長(zhǎng)曲線見圖9。

圖8 不同培養(yǎng)基中枯草芽胞桿菌的生長(zhǎng)曲線

圖9 不同培養(yǎng)基中大腸桿菌的生長(zhǎng)曲線

由圖8和圖9可知,⑥和⑦培養(yǎng)基中枯草芽胞桿菌生長(zhǎng)情況優(yōu)于⑧,即⑥和⑦的草魚內(nèi)臟水解蛋白優(yōu)于市售商品蛋白胨。將圖6和圖8作比較可以看出,枯草芽胞桿菌在加入鹽分和糖分的⑥和⑦培養(yǎng)基中比不加鹽分和糖分的②和③培養(yǎng)基生長(zhǎng)的好,而⑤和⑧培養(yǎng)基與①和④培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的枯草芽胞桿菌的生長(zhǎng)情況相差不大。

在以草魚內(nèi)臟水解蛋白為氮源,加入鹽分和糖分的培養(yǎng)基試驗(yàn)測(cè)得大腸桿菌的生長(zhǎng)曲線見圖9。由圖可知,⑥和⑦培養(yǎng)基中大腸桿菌生長(zhǎng)情況優(yōu)于⑧,即⑥和⑦培養(yǎng)基中的蛋白胨優(yōu)于市售商品蛋白胨。將圖6,圖8和圖6,圖9作比較可以看出,大腸桿菌在加入鹽分和糖分的⑥和⑦培養(yǎng)基中比不加鹽分和糖分的②和③培養(yǎng)基生長(zhǎng)的好,而⑤和⑧培養(yǎng)基與①和④培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的大腸桿菌的生長(zhǎng)情況相差不大。由圖1—圖4綜合可知,草魚內(nèi)臟蛋白水解液脫色脫腥后的凍干樣可以作為商品蛋白胨,這不僅將草魚內(nèi)臟等廢棄物得以利用,而且可以制成供微生物培養(yǎng)的營(yíng)養(yǎng)物制品。

3 結(jié)論

對(duì)三種蛋白胨功能性質(zhì)進(jìn)行測(cè)定,得到 3號(hào)樣的功能性質(zhì)最佳。試驗(yàn)中,3號(hào)樣的水溶性指數(shù)、乳化性、乳化穩(wěn)定性和起泡性最好,各最高值分別為：水溶性指數(shù) 99.8%;乳化性 73%;乳化穩(wěn)定性 75.9%;起泡性 162.8%。

利用不同培養(yǎng)基培養(yǎng)枯草芽孢桿菌和大腸桿菌,得到最佳生長(zhǎng)細(xì)菌的蛋白胨為 3號(hào)蛋白胨,即草魚內(nèi)臟蛋白水解液經(jīng)脫色脫腥處理后的樣品。

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