曾 馳,繆禮鴻,黃玉屏,陳向東,沈 萍

(1.武漢工業(yè)學(xué)院生物與制藥工程學(xué)院,湖北武漢 430023;2.武漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,湖北武漢 430072)

嗜鹽古生菌是古生菌中的一種重要類群,廣泛分布于各種高鹽生態(tài)系統(tǒng)中。嗜鹽古生菌可產(chǎn)生一類蛋白類抗生素,稱為嗜鹽菌素 (halocin)。與細(xì)菌素相似,嗜鹽菌素是由質(zhì)粒編碼,核糖體合成的。嗜鹽菌素由于性質(zhì)穩(wěn)定,潛在應(yīng)用領(lǐng)域廣泛,目前已成為極端嗜鹽古生菌研究的重要領(lǐng)域[1]。

最早的嗜鹽菌素是由 Rodriguez-Valera及其同事于 1982年發(fā)現(xiàn)的[2]。他們篩選了 40株極端嗜鹽古生菌,用敏感菌平板法研究了它們相互之間的抑制作用,發(fā)現(xiàn)有 7株產(chǎn)生抑菌物質(zhì),而且這些抑菌物質(zhì)對蛋白酶敏感。1986年,Meseguer用敏感菌平板法篩查了 79株嗜鹽菌之間的拮抗互作[3]。79株中77株有不同程度的抑菌作用,而且抑菌活性譜多種多樣。1994年,Torreblanca用雙層平板法篩查了 68株嗜鹽古生菌的相互拮抗[4]。除了一株菌,其它所有菌株都有抑菌作用。抑菌物質(zhì)被證明是蛋白——嗜鹽菌素。檢查到多種多樣的活性譜,數(shù)量分析不能將其聚類,其原因是它們之間的相似性太少。這表明桿狀嗜鹽古生菌產(chǎn)生各種不同的嗜鹽菌素。作者指出：“分泌嗜鹽菌素是桿狀嗜鹽古生菌的普遍特征?！敝锌圃何⑸锼蛉A于 2002年篩查了 22株極端嗜鹽古生菌之間的相互抑制,發(fā)現(xiàn)有 21株極端嗜鹽古生菌產(chǎn)生嗜鹽菌素,其中 6株抑菌譜較廣,可以抑制大多數(shù)菌株 (10-17株)[1]。目前,已發(fā)現(xiàn)有上百株極端嗜鹽古生菌可以產(chǎn)生嗜鹽菌素。

嗜鹽菌素的廣泛存在具有重要生態(tài)學(xué)意義。一方面,溶菌或抑菌作用可以減少競爭,優(yōu)先利用環(huán)境中的營養(yǎng)。另一方面,可以裂解敏感細(xì)胞,釋出內(nèi)容物,豐富環(huán)境中的營養(yǎng)。Oren觀察到高鹽湖泊和鹽水池塘中的嗜鹽古生菌種類很少,一般只有一個或幾個屬。很多研究者認(rèn)為嗜鹽菌素在嗜鹽古生菌的生態(tài)分布中起重要作用[5]。

一般認(rèn)為,嗜鹽菌素的抑制譜限于嗜鹽古生菌。但 2001年 Haseltine報道,微嗜鹽菌素可以抑制 Sulfolobus solfataricus(一種泉古生菌 )[6]。2002年 ,向華發(fā)現(xiàn)由 Halobacterium QD5產(chǎn)生的嗜鹽菌素對蠟狀芽孢桿菌 (Bacillus cereus)有一定的抑制作用[1]。2006年 Lequerica報道,Haloferax gibbonsii Ma2.39產(chǎn)生的嗜鹽菌素 H6也可抑制哺乳動物細(xì)胞的 Na+/H+antiporter[7]。

我們以 Halobacterium salinarumNRC817為敏感指示菌,用雙層平板法對武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏的 19株嗜鹽古生菌產(chǎn)生嗜鹽菌素的情況進行了篩查,其中 15株對 Hbt.salinarum NRC817表現(xiàn)出明顯拮抗,證實了前人的觀點：分泌嗜鹽菌素是嗜鹽古生菌的普遍特征。此外,我們以幾種常見的病原細(xì)菌為敏感指示菌對本研究嗜鹽古生菌所產(chǎn)嗜鹽菌素的抑菌能力進行了檢測,試圖探討其實際應(yīng)用前景和理論意義。

1 材料與方法

1.1 菌株及其來源

Hbt.salinarum NRC817是一株不產(chǎn)嗜鹽菌素的嗜鹽古生菌。它對目前所有已報道的嗜鹽菌素都敏感,被普遍用作嗜鹽菌素研究中的敏感指示菌。待測的 19株嗜鹽古生菌中 14株 (S9,R6-1,R6-7,13,H2,HQ,R1,J8,3,A1,11,J1,RF-1,J7)源于湖北應(yīng)城的一座鹽礦,其余 5株 (F8,F7,F5,F1,F11)為武漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物遺傳實驗室用二株具表型差異的鹽生鹽桿菌 J7和 R1經(jīng)滅活原生質(zhì)體融合得到的融合子[8]。以上所有嗜鹽古生菌菌株均保藏于武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心。

本研究所涉及的 10種病原細(xì)菌,包括大腸桿菌(Escherichia coli)、枯草芽孢桿菌 (Bacillus subtilis)、蘇云金芽孢桿菌 (Bacillus thuringiensis)、弗氏志賀氏菌 Shigella flexneri)、銅綠假單胞菌 (Pseudom onas aeruginosa)、金黃色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)、傷寒沙門氏菌 (Salm onella typhosa)、尿素八疊球菌 (Sarcina ureae)、熒光假單胞菌 (Pseudom onas fluorescens)、嗜麥芽假單胞菌 (Pseudom onas maltophilia),均保藏于武漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物遺傳實驗室。

1.2 培養(yǎng)基及其成分

培養(yǎng)嗜鹽古生菌使用 25%S W復(fù)合培養(yǎng)基 (嗜鹽菌培養(yǎng)基)：NaCl 195 g,MgCl2·6H2O 16.25 g,MgSO412.2 g,CaCl2·2H2O 0.84 g,KCl 5 g,NaHCO30.25 g,NaBr 0.63 g,酵母提取物 5 g,加水至1000 mL。調(diào) pH 7.0。1.034 ×105Pa滅菌 20 min。在上述液體培養(yǎng)基中補加 1.5%瓊脂粉,即為固體培養(yǎng)基。

培養(yǎng)病原細(xì)菌使用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基,其中NaCl濃度根據(jù)所培養(yǎng)病原細(xì)菌的極限耐鹽濃度而定。

1.3 用雙層平板技術(shù)檢測嗜鹽古生菌產(chǎn)嗜鹽菌素情況

在無菌平皿中倒約 20mL固體嗜鹽菌培養(yǎng)基待其凝固。將半固體嗜鹽菌培養(yǎng)基按 4mL/管分裝滅菌,完全熔化,置于 60℃水浴中。取 100μL生長至OD600為 0.65—0.75的 Halobacterium salinarum NRC817菌液,加入一支裝有 60℃左右的半固體嗜鹽菌培養(yǎng)基的試管,振蕩混勻 (不要產(chǎn)生氣泡),傾倒在底層培養(yǎng)基表面?？焖傩D(zhuǎn)平板,直到上層培養(yǎng)基完全覆蓋底層培養(yǎng)基,然后使其冷卻凝固。將10μL待測菌液點在雙層平板上,培養(yǎng)觀察。

1.4 用雙層平板技術(shù)檢測嗜鹽菌素對病原細(xì)菌的抑菌能力

首先測定了所用病原細(xì)菌的極限耐鹽濃度。以病原細(xì)菌為指示菌制雙層平板 (培養(yǎng)基 NaCl濃度為所用病原細(xì)菌的極限耐鹽濃度)。在平板上放置無菌濾紙片,在濾紙片上點 20μL對數(shù)期嗜鹽古生菌菌液,同時點新鮮嗜鹽菌培養(yǎng)基作為對照,37℃培養(yǎng) 7—10d,觀察結(jié)果。

2 結(jié)果與討論

2.1 嗜鹽古生菌產(chǎn)嗜鹽菌素情況

檢測結(jié)果如圖1所示。

圖1 用 Halobacterium salinarum NRC817為敏感指示菌用雙層平板法對中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏的 19株嗜鹽古生菌產(chǎn)生嗜鹽菌素的情況進行篩查

觀察經(jīng)培養(yǎng)的檢測平板,可以看出 19株待測的嗜鹽古生菌中,15株 (R1,S9,R6-1,R6-7,J1,J7,J8,A1,3,11,13,F1,F5,F7,H2)對 Hbt.salinarum NRC817表現(xiàn)出明顯拮抗,作用強弱有較大差別?？梢耘袛噙@ 15株菌均產(chǎn)生嗜鹽菌素。不能認(rèn)為沒有對 Hbt.salinarum NRC817表現(xiàn)出拮抗的 4株菌不產(chǎn)生嗜鹽菌素,可能 Hbt.salinarum NRC817不在它們所產(chǎn)嗜鹽菌素的抑菌譜內(nèi)?？傊?我們的結(jié)果證實了前人的觀點,即分泌嗜鹽菌素是嗜鹽古生菌的普遍特征。

在這 19株菌中,F1,F5,F7,F8,F11是 J7和 R1通過雙親滅活法進行原生質(zhì)體融合得到的融合子。注意到 J7和 R1均產(chǎn)嗜鹽菌素但作用都不強。5個融合子中 F5和 F7所產(chǎn)嗜鹽菌素遠(yuǎn)強于兩個親本,而 F8和 F11則對 Hbt.salinarum NRC817沒表現(xiàn)出抑制。只有 F1的拮抗強度和 J7相似。融合子表現(xiàn)出和兩親本差異較大的性狀,這可能與劇烈的致死誘變和高頻率重組有關(guān),其進一步的原因很值得探討,因為 F5和 F7這二株融合子不僅所分泌的嗜鹽菌素活性強,而且所產(chǎn)的胞外蛋白酶活性也高[9]。更有趣的是,這二株融合子還能產(chǎn)生一種新的噬菌體[10],相關(guān)工作正在進行中。

2.2 嗜鹽菌素對病原細(xì)菌的抑菌能力

由于普通細(xì)菌一般只能在低鹽環(huán)境中生長,但嗜鹽菌素在低鹽環(huán)境中會發(fā)生結(jié)構(gòu)改變和功能喪失,因此首先測定了所用病原細(xì)菌的極限耐鹽濃度,如表1所示。

表1 所用病原細(xì)菌的極限耐鹽濃度

根據(jù)各病原細(xì)菌的極限耐鹽濃度制含病原細(xì)菌的雙層平板,檢測嗜鹽古生菌菌液上清對病原細(xì)菌的抑菌能力。為了排除嗜鹽菌培養(yǎng)基的可能影響,同時檢測新鮮嗜鹽菌培養(yǎng)基的抑菌能力作為對照。在 NaCl濃度低于 8%的檢測平板 (分別涂布有大腸桿菌、蘇云金芽孢桿菌、弗氏志賀氏菌、銅綠假單胞菌、傷寒沙門氏菌、尿素八疊球菌、熒光假單胞菌和嗜麥芽假單胞菌)上,嗜鹽古生菌菌液點樣處有明顯抑菌透明圈,但點有嗜鹽菌培養(yǎng)基的位置也有明顯抑菌透明圈。推測嗜鹽菌培養(yǎng)基中的高鹽濃度本身就抑制上述細(xì)菌的生長,不能判斷“抑菌”中是否有“嗜鹽菌素”的作用。以枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌為指示菌的 8%NaCl檢測平板上,在點有嗜鹽菌菌液和嗜鹽菌培養(yǎng)基的地方都沒有觀察到抑菌現(xiàn)象。因此,本研究嗜鹽古生菌所產(chǎn)嗜鹽菌素的域外抑制譜乃至作為抑菌物質(zhì)的應(yīng)用前景還有待進一步研究。

[1] 厲云,向華,譚華榮.極端嗜鹽古菌蛋白類抗生素—嗜鹽菌素 [J].微生物學(xué)報,2002,42(4)：502-505.

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[3] Meseguer I,Rodriguez-Valera F,Ventosa A.Antagonistic interactions among halobacteria due to halocin production[J].FEMS Microbiol Letts,1986,36：177-182.

[4] Torreblanca M,Meseguer I,Ventosa A.Production of halocin is a practically universal feature of archaeal halophilic rods[J].Lett Appl Microbiol,1994,19(4)：201-205.

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[6] Haseltine C,Hill T,Montalvo-Rodriguez R,et al.Secreted euryarchaeal microhalocins kill hyper thermophilic crenarchaea[J].J Bacteriol 2001,183(1)：287-291.

[7] Lequerica J L,O’Connor J E,Such L,et al.A halocin acting on Na+/H+exchanger of haloarchaea as a new type of inhibitor in NHE of mammals[J].J Physiol Biochem.2006,62(4)：253-262.

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[9] 石萬良.嗜鹽古生菌 Natrinema sp.J7和融合子 F7的蛋白酶基因克隆、表達(dá)和性質(zhì)研究[D].武漢：武漢大學(xué),2006.

[10] Mei Y,Chen D,Sun D,et al.Identification homologous recombination function from haloarchaea plasmid pHH205[J].Curr Microbiol.2007,55(1)：76-80.