張大川，付云潔，劉志國(guó)，梁莉甜，李 琦

(武漢工業(yè)學(xué)院生物與制藥工程學(xué)院，湖北武漢430023)

免疫球蛋白作為一類重要的免疫效應(yīng)分子，是由高等動(dòng)物免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，通過(guò)抗原誘導(dǎo)可轉(zhuǎn)化為抗體。其中，IgG是存在于血液、淋巴、腹腔液中的主要免疫球蛋白，但它的存在介質(zhì)中含有非常復(fù)雜的混合物，為了消除雜蛋白干擾，獲得純度較高的IgG，本實(shí)驗(yàn)采用辛酸硫酸銨及親和層析兩種方法對(duì)血清進(jìn)行純化，并從純度、蛋白質(zhì)含量、抗體效價(jià)等方面比較兩種方法的純化效果，為今后的抗體純化提供一種高效實(shí)用的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試劑：辛酸、硫酸胺、環(huán)氧氯丙烷，分析純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司;Sepharose 4B，北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司;戊二醛，分析純，國(guó)藥集團(tuán)生物技術(shù)有限公司。

儀器：奧地利SUNRISE酶標(biāo)儀;天美8500紫外掃描儀;北京六一DYY-5型電泳儀;Kodak 1D凝膠成像系統(tǒng);科力生化培養(yǎng)箱。

1.2 方法

1.2.1 蘇丹紅I多克隆抗體的制備

按照常規(guī)程序［1］免疫新西蘭白兔，免疫中期對(duì)兔進(jìn)行耳緣靜脈取血，雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)檢測(cè)抗體效價(jià)，效價(jià)合格后通過(guò)頸動(dòng)脈采血的方法獲得抗血清。

1.2.2 蘇丹紅I多克隆抗體的純化

收集的抗血清分別通過(guò)辛酸硫酸銨法和親和層析柱法進(jìn)行純化。辛酸硫酸銨法參照文獻(xiàn)［2，3］進(jìn)行。

親和層析柱的制備方法如下［4，5］：取5 g經(jīng)環(huán)氧氯丙烷偶聯(lián)活化的瓊脂糖［6］，加入10mL氨水以使環(huán)氧基團(tuán)氨解，室溫反應(yīng)過(guò)夜。將水解后的瓊脂糖載體用蒸餾水大量沖洗并抽濾，加入30 mL 5%的戊二醛溶液，室溫反應(yīng)2 h，用大量蒸餾水沖洗并抽濾，得到帶有活性醛基的瓊脂糖凝膠。

將1.0 mL 0.5 mol/L 的磷酸鈉溶液(pH 7.5)和1.0 mL蘇丹紅 I-BSA抗原(10 mg/mL)加入0.5 g活化的瓊脂糖凝膠中，用搖床在室溫下震蕩混勻2 h或4℃過(guò)夜，0.5 mol/L磷酸鈉溶液(pH 7.5)洗滌微球。然后加入10倍體積的1 mol/L乙醇胺(pH 7.5)，室溫下孵育4 h，以屏蔽未反應(yīng)的環(huán)氧基團(tuán)。加入1%BSA室溫反應(yīng)2 h以封閉未反應(yīng)的醛基，用 PBS 洗凈備用［7］。

將抗血清用0.02 mol/L PBS以1∶10稀釋，緩慢過(guò)柱，用0.02 mol/L PBS洗滌以除去未結(jié)合的雜蛋白，再用3 mol/L硫氰酸鉀洗脫，收集特異性IgG抗體。硫氰酸鉀對(duì)抗體有破環(huán)作用，因此抗體收集完應(yīng)及時(shí)透析。

1.2.3 純化蘇丹紅Ⅰ多克隆抗體的測(cè)定

將上述兩種方法分別利用瓊脂雙向擴(kuò)散試驗(yàn)法檢測(cè)抗體的效價(jià)，BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)含量、SDSPAGE測(cè)定抗體的純度，比較兔抗IgG的純化結(jié)果。

2 結(jié)果與討論

2.1 抗蘇丹紅Ⅰ血清效價(jià)的測(cè)定

新西蘭兔免疫三周后，用瓊脂雙擴(kuò)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)抗體效價(jià)在1∶32，再加強(qiáng)免疫兩次，最后一次免疫完成，5 d后采用頸動(dòng)脈采血法收集血清。

經(jīng)辛酸硫酸銨純化后的抗血清效價(jià)為1∶64，親和層析法純化后的抗體效價(jià)為1∶128，因此，親和層析法的純化效果較為理想。

2.2 IgG純度的測(cè)定

將純化前的血清、親和層析法純化后的血清和辛酸硫酸銨純化后的血清進(jìn)行SDS-PAGE純度測(cè)定(圖1)。

圖1 SDS-PAGE電泳結(jié)果

結(jié)果表明，純化前的血清有多條帶，即含有較多的蛋白。經(jīng)辛酸硫酸銨純化后，有3—4條較明顯的條帶，血清經(jīng)純化后，大部分雜蛋白被除去;經(jīng)親和層析純化后，條帶較為明顯，有兩條帶，一條為重鏈，分子量約55 KD，另一條為輕鏈，分子量約14 KD，與IgG抗體的重鏈和輕鏈的分子量比較符合，說(shuō)明獲得的抗體較純。

2.3 IgG濃度的測(cè)定

BCA法分別測(cè)定純化前的血清、辛酸硫酸銨純化后的抗體以及親和層析柱純化后的抗體的蛋白含量。

BCA法測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖2)為：y=0.3851x+0.1967，由此得到的上述樣品蛋白質(zhì)濃度依次為：7.86 mg/mL，5.53 mg/mL，2.08 mg/mL。

圖2 BCA法標(biāo)準(zhǔn)曲線

3 結(jié)論

本研究采用親和層析法和辛酸硫酸銨法，分別純化兔抗蘇丹紅I多克隆抗體。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，兩種方法均能夠滿足免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)的要求，雖然辛酸硫酸銨法獲得的抗體濃度明顯高于親和層析法，但SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示，親和層析法獲得的抗體純度較高，為今后利用該特異性抗體制備膠體金免疫層析試紙、ELISA等免疫診斷實(shí)驗(yàn)奠定了良好的基礎(chǔ)。

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