汪 琳 周 琦 柏亞鐸 邢佑尚,2 趙胤澤,2 張鶴曉 蒲 靜 喬彩霞 蔣 迪 齊瑋

(1.北京出入境檢驗(yàn)檢疫局 北京 100026;2.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué);3.博奧生物有限公司)

1 前言

非洲馬瘟[1]是馬科動(dòng)物的非接觸性傳染病,被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織列為必須檢疫的重大動(dòng)物疫病。由于該病的巨大破壞性,在國(guó)際上進(jìn)行馬的運(yùn)輸過程中,尤其是在無 AHS的地區(qū),必須執(zhí)行嚴(yán)格的獸醫(yī)衛(wèi)生措施。西尼羅病毒[2]于二十世紀(jì)九十年代在歐洲和美洲開始暴發(fā),隨后在西半球不斷蔓延,不僅幾乎傳遍整個(gè)美國(guó),而且還進(jìn)入到加拿大、墨西哥和西印度群島等地區(qū),并成為這些地區(qū)一個(gè)重要的公共衛(wèi)生問題。2003年 SARS的出現(xiàn),引起人們對(duì)冠狀病毒[3]極大的關(guān)注。迄今為止,我國(guó)尚未發(fā)現(xiàn)這些病毒感染的臨床病例,但是我國(guó)的氣候、地理環(huán)境復(fù)雜,蚊蟲種類繁多,具備傳播條件,隨著國(guó)際交流的日益頻繁,傳入我國(guó)境內(nèi)的可能性非常大。預(yù)防病毒意外傳入的第一步是檢測(cè),由于我國(guó)目前尚沒有非洲馬瘟、西尼羅熱等病毒的病原體,長(zhǎng)期以來一直無法開展針對(duì)這些病毒的系統(tǒng)研究,缺乏對(duì)這些可能傳入我國(guó)的重大傳染病的快速、靈敏和特異的診斷技術(shù),一旦發(fā)生意外傳入和暴發(fā)事件將難以應(yīng)對(duì)。因此很有必要利用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù),在無病原體的情況下建立非洲馬瘟病毒、西尼羅熱病毒等的檢測(cè)方法,為防止這些病毒的傳入和發(fā)生突發(fā)感染事件時(shí)迅速排查可疑病例、鑒定病原以及采取有效的預(yù)防和控制措施提供技術(shù)支撐。

基因芯片技術(shù)[4]可將大量已知序列的核酸作為探針固定在玻片等載體上,與互補(bǔ)的核苷酸序列雜交,通過芯片雜交信號(hào),判斷待檢樣品中有無可疑病原體,一次試驗(yàn)可得出多條信息,具有快速、高通量、并行處理等優(yōu)點(diǎn),在疾病篩查中具有無可比擬的優(yōu)勢(shì)。本研究將芯片技術(shù)用于五種馬病檢測(cè)中,建立了同時(shí)檢測(cè)五種馬病病毒的芯片檢測(cè)快速篩查技術(shù)。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 質(zhì)粒、宿主菌、病毒及血清

原核表達(dá)質(zhì)粒 PET-30a、大腸桿菌 (E.coli)BL21(DE3)、馬鼻肺炎病毒和馬動(dòng)脈炎病毒[5]、待檢血清為北京出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)檢實(shí)驗(yàn)室保存;非洲馬瘟阻斷 EL ISA試劑盒 (內(nèi)含馬的 AHSV標(biāo)準(zhǔn)陽性血清和陰性血清)購(gòu)自西班牙 I NGENASA公司;西尼羅病毒購(gòu)自美國(guó) Fort Dodge Animal Health公司的滅活疫苗;馬冠狀病毒克隆質(zhì)粒引自澳大利亞獸醫(yī)研究所。

2.1.2 引物、探針序列合成與驗(yàn)證

引物序列:

EAV F-1:TTGTGGTGACGGGATTTTAG EAV R-1::TGTAGCTTGTAGGCTGTCGC

EAV F-2:GGCGACAGCCTACAAGCTAC EAV F-2:CGGCATCTGCAGTGAGTGA

EHVF:ACACGCAGGTCGCTACTAT EHV R:CTCTAGTTGTTTGGCGGTGA

ECV F:CAAACCAGAGGTAGGAGAGC ECV R:GTGCCATACTGGGCTTTAG

WNV F:CACAATGACAAACGTGCTG WNV R:CTTCCTATTGCCTTGGTAGA

AHSV F:GCGATAGCAGCAAGAGCCT AHSV R:GGCCTCATCGATACCGAATGA

每對(duì)引物的上游引物的 5’端標(biāo)記熒光,用于雜交檢測(cè)。

探針序列:

EAV orf6:AAATGGACCGAAGACGAGG EAV orf7:TCATAAAGAACCGCTGTACG

EHV-4 gB:CGTTTGTGTAGGCGATGTAG ECV N:ATACCAGCGTGGCAACAAT

WNV: TGTCCACCACTCCTTGTCTG AHSV:ACTCTCGCATCTGTCACTGT

人工合成的AHSV病毒片段:

AHSV-1

GCGATAGCAGCAAGAGCCTTGTCCGTTGTACG GGCATGCGTCACAGTGACAGATGCGAG

AHSV-2

TTGCAATCCCTAACGTCTCCATCACTCCTGGAT CCAAGCTAACTCTCGCATCTGTCACT

AHSV-3

CCTCATCGATACCGAATGATTCGTTAAACCATT GTACCTATTAATTGCAATCCCTAACG

2.1.3 主要試劑及儀器

Cy3-dCTP購(gòu)自 Amersham Biosciences公司 ;芯片、雜交盒、芯片掃描儀 (Luxscan 10k/B)博奧生物有限公司生產(chǎn),其他化學(xué)試劑均為分析純。

2.2 方法

2.2.1 核酸模板制備

本項(xiàng)目中檢測(cè)的五種病原體來源不同,擴(kuò)增模板的制備也不相同。EAV病毒和 EHV-4病毒模板采用MN提取試劑盒提取的 EAV病毒 RNA和EHV-4病毒 DNA;ECV病毒和WNV病毒擴(kuò)增模板為質(zhì)粒模板;AHSV為人工合成的核酸片段,先用PCR擴(kuò)增進(jìn)行連接,擴(kuò)增后的產(chǎn)物與 T-載體連接過夜,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。轉(zhuǎn)化后的菌株進(jìn)行培養(yǎng)和篩選,篩選出的克隆進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證,驗(yàn)證正確的菌株進(jìn)行質(zhì)粒提取,提取的質(zhì)粒用于 PCR擴(kuò)增。

2.2.2 多重不對(duì)稱 RT-PCR擴(kuò)增

本項(xiàng)目需要同時(shí)檢測(cè)馬病的五種病毒,因此建立多重不對(duì)稱 RT-PCR擴(kuò)增體系。實(shí)驗(yàn)中上游熒光標(biāo)記引物濃度相同,均為 0.2μM,下游引物濃度根據(jù)設(shè)定的引物比例進(jìn)行調(diào)整。整個(gè)反應(yīng)循環(huán)程序分為正常的擴(kuò)增和高溫退火兩個(gè)階段。

2.2.3 芯片上探針點(diǎn)陣排布

芯片上點(diǎn)制 2條陰性對(duì)照、3條陽性對(duì)照和 5條病毒檢測(cè)探針,每條探針設(shè)置三個(gè)重復(fù)。陰性對(duì)照是合成的一段植物基因片段,陽性對(duì)照為合成的與靶基因沒有同源性的核酸片段,以監(jiān)控雜交反應(yīng)是否有效。

2.2.4 芯片雜交反應(yīng)

芯片雜交液組成成分為:10μL雜交緩沖液 +8μL PCR產(chǎn)物,雜交溫度 50℃,雜交時(shí)間 2h。雜交后的芯片洗滌后掃描,掃描參數(shù)為:激光 Power 90%,PMT 70%。

2.2.5 芯片特異性和靈敏度實(shí)驗(yàn)

分別提取馬傳染性貧血病毒 (EIAV)、馬腺病毒I型 (EHV-1)、牛鼻氣管炎病毒 (IBRV)、豬胃腸炎病毒 (TGEV)的 RNA,擴(kuò)增與芯片雜交,驗(yàn)證芯片檢測(cè)體系的特異性。

對(duì)建立的檢測(cè)體系進(jìn)行靈敏度評(píng)價(jià),實(shí)驗(yàn)方法為:對(duì) AHSV、ECV和WNV質(zhì)粒,EAV和 AHV病毒核酸進(jìn)行紫外定量,算出濃度 (1A260吸光度值 =ds DNA50mg/mL=ss DNA33mg/mL=ss RNA40mg/mL),根據(jù)病毒的分子量算出病毒的拷貝數(shù),然后對(duì)提取的核酸溶液進(jìn)行 10倍系列稀釋,用稀釋后的核酸溶液做為模板進(jìn)行多重?cái)U(kuò)增,擴(kuò)增后的產(chǎn)物進(jìn)行芯片雜交,根據(jù)雜交結(jié)果判斷每種病毒的檢測(cè)下限?？截悢?shù)計(jì)算公式:(6.02×1023copies/mol)×(濃度 g/mL)/(MW g/mol)=copies/mL。

2.2.6 芯片檢測(cè)重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

按照優(yōu)化好的芯片反應(yīng)體系,對(duì) 5種馬病病毒同時(shí)檢測(cè),進(jìn)行 3個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn),根據(jù)掃描結(jié)果,驗(yàn)證芯片重復(fù)性。

3 結(jié)果與討論

3.1 探針有效性的驗(yàn)證

通過實(shí)驗(yàn)篩選雜交信號(hào)強(qiáng),相互無交叉反應(yīng)的檢測(cè)探針,最后篩選出了用于五種病毒檢測(cè)的 5條探針,芯片雜交效果見圖 1,用于多重檢測(cè)體系的建立。

圖 1 馬病病毒探針驗(yàn)證結(jié)果

3.2 特異性驗(yàn)證

分別提取 EI AV、EHV-1、I BRV和 TGEV的RNA,經(jīng) RT-PCR和擴(kuò)增后分別與芯片進(jìn)行雜交,掃描結(jié)果顯示,除陽性參照外,其余位點(diǎn)均無雜交信號(hào),說明設(shè)計(jì)的引物與其他病毒無交叉反應(yīng)。

圖 2 交叉反應(yīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果

圖 3 五種病毒混合雜交反應(yīng)結(jié)果

3.3 芯片檢測(cè)體系的建立

通過對(duì)引物濃度、多重 PCR反應(yīng)循環(huán)數(shù)、雜交溫度、雜交時(shí)間的優(yōu)化,建立了馬病芯片檢測(cè)體系:上下游引物濃度比例為 5:1,第一步 PCR為 25個(gè)循環(huán)和第二步 PCR為 15個(gè)循環(huán),雜交溫度為 50℃,雜交時(shí)間為 2h。五種病毒核酸同時(shí)與芯片雜交,無干擾現(xiàn)象都能出雜交信號(hào),見圖 3所示。

3.4 馬病芯片檢測(cè)靈敏度評(píng)價(jià)

對(duì)建立的檢測(cè)體系進(jìn)行了靈敏度評(píng)價(jià),實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖 4。

圖 4 芯片檢測(cè)體系各病毒靈敏度評(píng)價(jià)

雜交結(jié)果顯示,EAV病毒、ECV質(zhì)粒樣品、WNV質(zhì)粒樣品檢測(cè)靈敏度為 102copies;AHSV質(zhì)粒樣品檢測(cè)靈敏度為 104copies;EHV-4病毒樣品質(zhì)粒樣品檢測(cè)靈敏度為 103copies。

3.5 芯片檢測(cè)重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

圖 5 芯片雜交檢測(cè)體系重復(fù)性

3.6 進(jìn)口馬全血樣品的基因芯片篩查

將馬病基因芯片應(yīng)用于 450份臨床馬血清的篩查,非洲馬瘟、西尼羅熱、馬冠狀病毒全部為陰性,檢出 6份馬動(dòng)脈炎病毒陽性,2份馬鼻肺炎病毒陽性,與病毒中和試驗(yàn)結(jié)果一致。

4 討論

基因芯片檢測(cè)方法具有快速、靈敏和高通量等特點(diǎn),可對(duì)多個(gè)基因位點(diǎn)的信息進(jìn)行分析,可最大限度保證檢出率。本研究建立的馬病芯片檢測(cè)方法,在一次實(shí)驗(yàn)中可同時(shí)檢測(cè) 5種馬病毒,將檢疫檢疫時(shí)間由 1-2周縮短在 7h內(nèi)完成。芯片上設(shè)置了芯片表面化學(xué)質(zhì)控點(diǎn)、雜交陽性對(duì)照點(diǎn)、空白對(duì)照點(diǎn)和每種病毒核酸對(duì)應(yīng)的特異核酸探針,并且每條探針點(diǎn)設(shè)置 3個(gè)平行重復(fù),只有 3個(gè)點(diǎn)同時(shí)出現(xiàn)信號(hào)才判定為有效結(jié)果,有效避免了檢測(cè)過程中易出現(xiàn)的假陽性、假陰性現(xiàn)象,對(duì)芯片檢測(cè)體系的重復(fù)性試驗(yàn)表明所建立的檢測(cè)體系具有很好的重復(fù)性,芯片批間差異輕微,本研究建立的芯片快速高通量基因芯片檢測(cè)方法可應(yīng)用于大規(guī)模出入境馬屬動(dòng)物的快速篩查。

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