王國民 彭濤 陳冬東 郗存顯 李應國

(1.重慶出入境檢驗檢疫局 重慶 400020;2.中國檢驗檢疫科學研究院)

1 前言

β2-受體激動劑是一類人工合成藥物,主要用于防治人、獸支氣管哮喘及痙攣。研究發(fā)現(xiàn)該類藥物添加到飼料中后具有營養(yǎng)再分配作用,可以顯著提高動物的瘦肉率而曾被作為促生長添加劑受到廣泛關注。由于長期使用、屠宰前期使用或濫用β2-受體激動劑,會造成其在動物組織中的大量殘留,進入人體后引起肌肉振顫、心動過速、心悸和過敏等急性中毒癥狀[1],甚至嚴重影響運動能力[2]和生殖系統(tǒng)[3],最終產生致畸、致突變和致癌等效應。因此,世界各國已禁止β2-受體激動劑作飼料添加劑。

目前,β2-受體激動劑的主要確證方法是高效液相色譜 -串聯(lián)質譜法 (LC-MS/MS)[4-7]。液相色譜 -串聯(lián)質譜的定性能力強、定量測定靈敏度高,但在定量分析復雜樣品中的痕量化合物時易受樣品基質的干擾,且通常情況下分析物響應的抑制或增強會降低測定的精密度和準確度[8-9]。本文參照 Lian Wang[10]的樣品酶解方法,即使用乙酸銨60℃酶解 2 h后提取豬肉、豬肝和魚肉樣品中的痕量沙丁胺醇、克倫特羅和特布他林方法,分別采用SN/T 1924-2007[6]和王鳳美[7]所使用的 C18-SCX串聯(lián)柱及 MCX固相萃取柱凈化,按照 Matuszewski等[11]建立的數(shù)學模型評定考察 LC-MS/MS測定這幾種β2-受體激動劑的基質效應,為定量方法的選擇提供參考依據(jù)。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 主要儀器

WatersQuattro Premier超高效液相色譜 -串聯(lián)質譜儀 (美國 Waters公司);R-200型旋轉蒸發(fā)儀(BüCH I);KQ-600型超聲波清洗器 (昆山市超聲儀器有限公司);XH-B型旋渦混勻器(江蘇康健醫(yī)療用品有限公司);Z323K型離心機 (德國,HERMLE);Silentcrusher M型高速勻質器 (德國 Heidolph)。

2.1.2 主要試劑與材料

乙腈、甲醇均為 HPLC級;乙酸銨為優(yōu)級純;沙丁胺醇、鹽酸克倫特羅和特布他林標準樣品:純度大于 99.0%,均購于德國 Dr.公司;其余化學試劑均為分析純;β-鹽酸葡萄糖醛苷酶 -芳基硫酸酯酶混合溶液:購于 Sigma公司,混合液中含β-鹽酸葡萄糖醛苷酶 94400U/mL,芳基硫酸酯酶 1079U/mL。MCX固相萃取柱:Waters Oasis,3mL,60 mg;C18固相萃取柱:SUPELCO,3mL,500 mg;SCX固相萃取柱:SUPELCO,3mL,500 mg。

2.2 方法

2.2.1 標準溶液配制

標準儲備液:分別準確稱取適量沙丁胺醇、鹽酸克倫特羅和特布他林用甲醇溶解,配制成濃度為100μg/mL的混合標準儲備液;

標準工作溶液:根據(jù)需要用流動相將標準儲備液稀釋成 2-100.0ng/mL的混合標準工作溶液。

2.2.2 液相色譜 -串聯(lián)質譜條件

色譜柱:Phenomenex Kinetex-C182.1(i.d)×100 mm(2.6μm);

1)這次暴雨天氣是南下的弱冷空氣與副熱帶高壓西北側的暖濕空氣在長江中下游交匯造成的;低空急流為暴雨輸送水汽和能量,切變線為對流的發(fā)展提供低層輻合上升條件。

流動相:乙腈 +5mmol/L乙酸銨緩沖液 (含0.2%甲酸);

流速:0.2mL/min;

進樣體積:10μL;

電離方式:ESI+;毛細管電壓:3.5 kV;離子源溫度:110℃,脫溶劑氣溫度:400℃;錐孔氣流量(N2):50 L/h,脫溶劑氣流量 (N2):600L/h,碰撞室壓力 (Ar):3.6e-3(mbar),碰撞氣流量 (Ar):0.3 mL/min。定性離子對、定量離子對、錐孔電壓、碰撞能量、駐留時間見表 1。

表 1 待測物定性離子對、定量離子對、錐孔電壓、碰撞能量、駐留時間

2.2.3 樣品處理

2.2.3.1 樣品提取

同時準確稱取 5份勻漿后不含待測物沙丁胺醇、鹽酸克倫特羅和特布他林的樣品 (豬肉、魚肉及豬肝)10.0g,參照 LianWang[10]的樣品酶解方法,即分別加入 20.0mL 2.0 mol/L乙酸銨緩沖溶液 (pH 5.2),高速勻質 2 min。加入 50μLβ-鹽酸葡萄糖醛苷酶 -芳基硫酸酯酶混合溶液,超聲提取 15 min。在 60℃恒溫箱中酶解 2 h后,以 3000 r/min離心 10 min。上清液分別作為MCX和 C18-SCX柱的待凈化液。

2.2.3.2 樣品凈化

2.2.3.2.1 MCX柱凈化

(1)依次采用 3mL甲醇、3mL水活化 MCX小柱,移取上待凈化液 2.5mL,以 1滴 /s的流速全部通過MCX小柱,然后用 3mL水、3mL甲醇水 (1+1)進行淋洗,最后用 5mL 5%的氨化甲醇洗脫。

(2)洗脫液于 40℃下氮氣濃縮吹干后,用 0.5mL濃度為 2ng/mL的標準混合工作溶液定容,供 UPLC-MS/MS進行提取后添加法基質效應測試。

2.2.3.2.2 C18-SCX串聯(lián)柱凈化

(1)將 C18和 SCX小柱串聯(lián),SCX小柱在下,依次用 5mL水、5mL甲醇及 5mL 0.03 mol/L鹽酸活化,移取上待凈化液 2.5mL,以 1滴 /s的流速全部通過小柱,然后用 5mL水,5mL甲醇淋洗,最后用12mL乙酸乙酯氨水 (97+3)溶液洗脫。

(2)洗脫液于 40℃下氮氣濃縮吹干后,用0.5mL濃度為 2ng/mL的標準混合工作溶液定容,供UPLC-MS/MS進行提取后添加法基質效應測試。

2.2.4 基質效應評價方法

按照Matuszewski等[11]建立的數(shù)學模型評定基質效應的影響。采用提取后添加法,比較 2個不同條件下的信號峰面積平均值,其中 Sl為標準品溶液的色譜峰面積,S2為動物源性樣品基質提取后添加標準溶液后的色譜峰面積,則絕對基質效應(ME%)=S2/Sl×100%。當 ME為 100%時,表明沒有絕對基質效應;當ME ＞100%時,表明有信號增強;當ME ＜100%時,表明有信號抑制。

3 結果與討論

基質是樣品中被分析物以外的組分,常對分析物的分析有顯著干擾 (信號增強或抑制),這種影響和干擾被稱為基質效應。LC-MS/MS普遍存在基質效應[12],基質效應會影響檢測方法的準確度和精密度,甚至認為[13]基質效應已成為液相色譜 -串聯(lián)質譜的“致命”缺點。目前對于基質效應產生的確切機理還不太清楚,但大都認為是由于分析物的共流出組分影響電噴霧接口的離子化效率。Cech[14]、King[15]等研究認為,基質效應由形成帶電霧滴時非揮發(fā)性的基質組分與分析物離子競爭產生的,這些非揮發(fā)性基質組分將霧滴牢牢吸在一起,阻止其分裂成更小的微滴。因此,在用 LC-MS/MS測定時需要考察和消除基質效應[17]。一些分析工作者提出了使用基質匹配溶液、同位素標記內標溶液、優(yōu)化樣品前處理條件和改進液相色譜串聯(lián)質譜分析條件等[18]解決基質效應的許多方法。但是,使用基質匹配溶液在操作上非常麻煩,前處理工作量大;同位素內標雖可抵消質譜離子化時的基質效應和消除樣品前處理中的差異,但標記物價格昂貴且不易獲取,在一般實驗室很難作為常用方法,且在同時檢測多個分析物時很難抵消基質效應,造成定量結果出現(xiàn)偏差。因此,優(yōu)化樣品前處理方法、純化樣品、盡可能地減少最終提取液中的基質成分是消除基質效應最為有效和徹底的方法。

3.1 MCX柱凈化后的基質效應

圖 1是魚肉、豬肉和豬肝樣品酶解提取液經MCX柱凈化后,UPLC-MS/MS測定 CL、SAL和 TE時的絕對基質效應,可以看出,3種組織樣品都存在較強的信號抑制,并且對 CL、SAL和 TE 3種目標物的信號抑制順序均為:豬肝 ＞魚肉 ＞豬肉。3種目標物中以 CL的信號抑制最強,對 TE和 SAL的信號抑制差異不明顯。

圖 1 MCX柱凈化后的基質效應

3.2 C18-SCX串聯(lián)柱凈化后的基質效應

圖 2是魚肉、豬肉和豬肝樣品酶解提取液經 C18-SCX串聯(lián)柱凈化后,UPLC-MS/MS測定 CL、SAL和 TE時的絕對基質效應,可以看出,3種樣品都存在信號抑制。對于具體檢測目標物,CL的信號抑制最強,TE的信號抑制相對較小。而對于組織樣品,以魚肉的信號抑制增強,其次是豬肉和豬肝。SAL和 TE 3種物質的信號抑制順序相同 (魚肉 ＞豬肉 ＞豬肝)。

圖 2 C18-SCX串聯(lián)柱凈化后的基質效應

3.3 兩種凈化方法的基質效應比較及原因分析

由圖 1圖 2可知,采用 C18-SCX串聯(lián)柱凈化方法的基質效應要明顯小于MCX凈化方法,特別是對于目標物特布他林和沙丁胺醇,而對于克倫特羅,兩種凈化方法的差異不明顯。對于具體組織樣品,兩種凈化方法的基質效應表現(xiàn)也不一樣,豬肝樣品采用MCX凈化的信號抑制最強,而魚肉樣品采用C18-SCX串聯(lián)柱凈化的信號抑制最強。產生差異的原因在于:根據(jù) Antignac[19]等的研究,引起基質效應的干擾物質分為“內源性抑制”和“外源性抑制”物質,內源性抑制物質主要是指本來存在于樣品基質中,而經過提取后仍然存在于提取物中,包括鹽、高極性化合物、表面活性劑、有機分子如各種糖類、胺類、脂類、肽類,或與分析目標物化學結構接近的代謝產物;外源性抑制主要是指由樣品制備及色譜分析過程中引入的干擾物,如塑料和聚合物的殘留、鄰苯二甲酸鹽、離子對試劑、有機酸、緩沖液、SPE柱材料、流動相等,由于豬肝、豬肉及魚肉樣品中的有機化合物如糖類、胺類、脂肪等含量有較大差異,同時 SCX屬于強陽離子凈化材料,而 MCX為混合陽離子凈化材料,因此對樣品中干擾物的去除能力也不一樣。

4 結論

綜上,對于同一檢測目標物,采用不同的凈化方法,其在UPLC-MS/MS檢測中所表現(xiàn)的基質效應完全不同。采用目前標準方法及文獻報道的MCX和 C18-SCX串聯(lián)柱 SPE柱凈化,均不能消除UPLC-MS/MS測定克倫特羅、沙丁胺醇和特布他林的基質效應,均存在較強的信號抑制。從提高檢測結果的準確性來看,兩種凈化方法均不能消除基質效應。因此,在樣品定量時需要采用基質匹配標準溶液或同位素內標及其他凈化手段來消除基質效應。

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