劉 丹 , 濮社班 , 朱玲英 , 錢士輝＊

(1.江蘇省中醫(yī)藥研究院中藥化學(xué)研究室,江蘇南京 210028;2.中國藥科大學(xué)生藥學(xué)研究室,江蘇南京 211198)

紅參是由五加科植物人參 (Panax ginseng C.A.M eyer)的栽培品經(jīng)蒸制后所得的干燥根和根莖[1]。人參皂苷是其最主要的有效成分之一[2],也是判斷其質(zhì)量優(yōu)劣的重要指標(biāo)之一。目前國內(nèi)外采用高效液相色譜法測定紅參中人參皂苷的研究報(bào)道較多[3-7]。2010年版《中國藥典》(一部)紅參項(xiàng)下要求對其主要成分 Rg1、Re和 Rb1的含量進(jìn)行測定[1]。此外,Ro也是紅參中人參皂苷的主要成分之一,其含量對紅參藥材質(zhì)量的評價(jià)有重要意義[4]。本課題組從紅參中分離得到了人參皂苷Rg1、Re、R f、Rb1、Rc和 Ro。本文采用反相高效液相色譜法同時(shí)測定不同產(chǎn)地紅參中上述各皂苷成分的含量,旨在為紅參藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提高提供依據(jù)。

儀器與試藥

1.1 儀器

W aters2695高效液相色譜儀(四元泵自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng));W aters 2996二極管陣列紫外檢測器; Empower化學(xué)工作站(美國沃特世公司);M ETTLER TOLEDO AT-201十萬分之一電子天平 (梅特勒-托利多儀器上海有限公司);BUCH IR-200旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士步琪公司);KQ-500B型超聲波清洗器 (功率: 250W,頻率:50 kHz,昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試藥

人參皂苷 Rg1、Re、R f、Rb1、Rc和 Ro對照品均為自制,歸一化法測得其純度均大于 98%。不同產(chǎn)地藥材共 10批,購于吉林 (集安、撫松、通化北、長白山、汪清縣、安圖、靖宇)和遼寧 (撫順、本溪、新賓),經(jīng)江蘇省中醫(yī)藥研究院錢士輝研究員鑒定為紅參。乙腈(美國 TED IA公司)、甲醇 (江蘇漢邦科技有限公司)均為色譜純;磷酸為分析純;水為重蒸餾水(M illi-Q純水器制得)。

方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為 A lltim aTM-C18(250 mm×4.6 mm, 5μm),流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸水溶液,梯度洗脫(0～35 m in,19%乙腈;35～55 m in,19%乙腈→29%乙腈;55～60 m in,29%乙腈;60～85 m in, 29%乙腈→40%乙腈);流速:1.0 m L·m in-1;檢測波長:203 nm;柱溫:30℃,進(jìn)樣量:10μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 取已干燥至恒重的人參皂苷 Rg1、Re、R f、Rb1、Rc和Ro對照品各約5m g,精密稱定,分別置 5mL容量瓶中,以甲醇溶解稀釋并定容至刻度,搖勻,即分別得人參皂苷 Rg1、Re、R f、Rb1、Rc和 Ro對照品儲(chǔ)備液。取 10m L量瓶一只,分別精密加入上述對照品儲(chǔ)備液 2.0、0.5、0.5、2.5、1.0和 2.5mL,加甲醇稀釋至刻度,搖勻,得混合對照品溶液,上述各成分質(zhì)量濃度分別為 0.201、0.051、0.052、0.253、0.102和 0.256 g·L-1。

2.2.2 供試品溶液的制備 取紅參粉末 (過 4號(hào)篩,孔徑 4.75mm)約 1 g,精密稱定,置索氏提取器中,加三氯甲烷適量,加熱回流 3 h,棄去三氯甲烷液,藥渣揮干溶劑,連同濾紙筒移入具塞錐形瓶中,精密加入水飽和的正丁醇 50mL,密塞,放置過夜,超聲處理 30m in,濾過,精密吸取續(xù)濾液 25 m L,置蒸發(fā)皿中蒸干,殘?jiān)蛹状既芙獠⑥D(zhuǎn)移至5mL量瓶中,加甲醇至刻度,搖勻,即得。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

按“2.2”項(xiàng)下方法制得混合對照品和供試品溶液,并按“2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)樣測定,結(jié)果顯示,混合對照品中各人參皂苷的保留時(shí)間與供試品中的一致,供試品中各人參皂苷成分達(dá)到有效分離。結(jié)果見圖1。

圖1 Rg1、Re、R f、Rb1、Rc和 Ro對照品及紅參樣品色譜圖Figure 1 HPLC chrom atogram sof reference substancesof Rg1,Re,R f,Rb1,Rc,Ro and samp le of red ginseng

2.4 線性關(guān)系的考察

分別精密吸取“2.2.1”項(xiàng)中制備的混合對照品溶液 3、10、15、20、25和 30μL,進(jìn)樣測定,記錄色譜圖。以峰面積為縱坐標(biāo) (Y),待測組分的質(zhì)量 (μg)為橫坐標(biāo)(X),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并進(jìn)行線性回歸。結(jié)果顯示,Rg1、Re、R f、Rb1、Rc和 Ro的質(zhì)量分別在0.603～6.03μg、0.153～1.53μg、0.157～1.57μg、0.758～7.58μg、0.306～3.06μg和 0.768～7.68μg范圍內(nèi)時(shí),質(zhì)量與峰面積均呈良好的線性關(guān)系,線性方程分別為:

2.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取“2.2.1”項(xiàng)中制備的混合對照品溶液10μL,連續(xù)進(jìn)樣 6次,測定峰面積,結(jié)果得 Rg1、Re、R f、Rb1、Rc和 Ro峰面積的 RSD(n=6)分別為1.0%、1.3%、1.8%、1.2%、1.4%和 1.2%。表明本方法精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一產(chǎn)地(吉林靖宇)藥材 1.0 g,精密稱定,平行 6份,按“2.2.2”項(xiàng)下方法制得供試品溶液,進(jìn)樣測定,結(jié)果得Rg1、Re、R f、Rb1、Rc和 Ro含量的平均值(n=6)分別為 0.230%、0.044%、0.064%、 0.344%、0.130%和 0.364%,RSD分別為 1.3%、1.5%、1.7%、0.8%、1.7%和 1.0%。表明本方法重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一產(chǎn)地 (吉林靖宇)藥材,按“2.2.2”項(xiàng)下方法制得供試品溶液,分別于 0、2、4、8、12 h進(jìn)樣,測定峰面積,結(jié)果得 Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc和Ro峰面積的 RSD(n=5)分別為 1.4%、1.3%、1.9%、0.90%、1.8%和 1.1%。表明供試品溶液在 12 h內(nèi)基本穩(wěn)定,本方法有良好的穩(wěn)定性。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的紅參粉末 (吉林靖宇),過 4號(hào)篩,取約 0.5 g,精密稱定,人參皂苷 Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc和 Ro的含量分別為 0.228%、0.044%、0.063%、0.339%、0.130%和 0.302%,分別加入Rg1、Re、R f、Rb1、Rc和 Ro對照品 1.140、0.219、0.316、1.705、0.650和 1.510 m g,平行 6份,按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備回收率測試溶液,進(jìn)樣測定,結(jié)果得人參皂苷 Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc和 Ro平均回收率 (n=6)分別為 101.3%、99.2%、98.1%、97.6%、100.7%和 99.0%,RSD分別為 0.41%、2.03%、1.03%、0.33%、2.31%和 1.87%。

2.9 樣品含量測定

取不同產(chǎn)地的樣品各 3份,精密吸取按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備的供試品溶液,進(jìn)樣測定,按外標(biāo)法計(jì)算樣品中 Rg1、Re、R f、Rb1、Rc和 Ro的平均含量,結(jié)果見表1。

表1 不同產(chǎn)地紅參中人參皂苷 Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc和 Ro的平均含量(n=3)Tab le 1 Determ ination resultsof ginsenosidesRg1,Re,R f,Rb1,Rc,Ro in red ginseng of differentorigins

討論

本試驗(yàn)分別比較了索氏脫脂后超聲提取、加熱回流提取、超聲提取 3種不同方法的提取效果,結(jié)果發(fā)現(xiàn)按藥典方法進(jìn)行脫脂后超聲提取效果較好。

對乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸水溶液 2種不同流動(dòng)相的考察結(jié)果表明,以乙腈-0.1%磷酸水溶液為流動(dòng)相時(shí)可獲得較好的分離效果,原因可能是人參皂苷Ro為齊敦果烷型酸性皂苷,加入0.1%磷酸可改善峰形。人參皂苷 Rg1、Re的結(jié)構(gòu)相似,保留時(shí)間非常相近,故較難分離,經(jīng)反復(fù)摸索,發(fā)現(xiàn)在50m in左右才能完全達(dá)到基線分離;比較不同梯度下的色譜圖,僅在“2.1”項(xiàng)中所用梯度下各成分均能達(dá)到基線分離,其他梯度條件雖能縮短分析時(shí)間,但各成分不能達(dá)到基線分離,故此梯度為最佳條件。

本實(shí)驗(yàn)對10批藥材中的人參皂苷 Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、Ro的含量測定結(jié)果顯示,Rg1、Re和 Rb1的含量分別介于 0.189%～0.236%、0.045%～0.137%和 0.215%～0.654%,表明不同產(chǎn)地的紅參藥材中人參皂苷 Rg1、Re、Rb1的含量均能達(dá)到2010年版《中國藥典》紅參項(xiàng)下的要求[1]。另 3種人參皂苷 Rf、Rc和 Ro的含量分別介于 0.030%～0.089%、0.106%～0.275%和 0.139%～0.576%。表2結(jié)果顯示,吉林長白山所產(chǎn)紅參中 6種皂苷的總量較高,遼寧新賓所產(chǎn)紅參中 6種皂苷的總量偏低;此外,不同產(chǎn)地人參皂苷Rb1、Ro的含量差異也較大。

荊淑芹等[6]測定了紅參中 Rb2、Rd等 7種人參皂苷的含量,未報(bào)道人參皂苷 Ro的含量。本實(shí)驗(yàn)未從紅參樣品中檢出人參皂苷 Rb2、Rd,也未分離純化到 Rb2、Rd的對照品;而從樣品中某一成分與標(biāo)準(zhǔn)品中 Ro的保留時(shí)間和吸收光譜值相同,且在樣品中加入標(biāo)準(zhǔn)品 Ro后樣品中該成分色譜峰的峰面積增大等現(xiàn)象可確定樣品中該成分為 Ro。以上結(jié)果的差異可能與紅參產(chǎn)地的生態(tài)環(huán)境及紅參的種植、采收、加工炮制有關(guān),應(yīng)重視人參的種植、采收、加工炮制等的進(jìn)一步規(guī)范化研究。

[1] 國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典:一部[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010:143.

[2] 楊秀偉.紅參的化學(xué)、藥理和臨床研究進(jìn)展[J].中成藥研究,1984,28(5):30-33.

[3] Sam ukawa Keiichi,Yamashita H ideyuki,M atsuda H ideaki,et a l.Sim ultaneous analysis of saponins in Ginseng Rad ix by high perform ance liquid chrom atography[J].Chem Pharm Bu ll,1995,43(1):137-141.

[4] Sam ukawa Keiichi,H ideyuki Yam ashita,M atsuda H ideaki,et a l.Sim u ltaneous analysis of ginsenosides of various ginseng radix by HPLC[J].Yakugaku Zasshi,1995,115 (3):241-249.

[5] W ashida Daisuke,Kitanaka Susum u.Determ ination of polyacetylenes and ginsenosides in Panax species using high perform ance liquid chrom atography[J].Chem Pharm Bu ll,2003,51(11):1314-1317.

[6] 荊淑芹,姜海平,劉鳳云,等.生曬參紅參林下參中 7種人參皂苷含量的比較 [J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊,2009, 27(1):207-209.