王曉蘭，王靜梅，剡根強(qiáng)，韓偉

（石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，石河子832003）

1985年Bau首次從Bottom yeast中分離出α－半乳糖苷酶，但是直到20世紀(jì)80年代，學(xué)者們才開(kāi)始對(duì)α－半乳糖苷酶進(jìn)行大規(guī)模的深入研究，目前該酶在食品、飼料、醫(yī)藥工業(yè)等領(lǐng)域的應(yīng)用受到高度重視。

α－半乳糖苷酶（α－Galactosidase，E．C．3．2．1．22），屬外切糖苷酶類，特異性水解具有α－半乳糖苷結(jié)構(gòu)的碳水化合物，如蜜二糖、棉子糖和水蘇糖等低聚糖［1］。通過(guò)對(duì)各種碳水化合物為基質(zhì)的蜜二糖酶特性的研究，發(fā)現(xiàn)該酶的主要作用對(duì)象是以具有α－半乳糖苷［3］結(jié)構(gòu)的碳水化合物，因此后來(lái)將蜜二糖酶命名為α－半乳糖苷酶。

奶牛乳房炎是影響新疆奶業(yè)發(fā)展的主要因素，所以調(diào)查奶牛乳房炎病原［2］，選擇有效藥物預(yù)防和治療奶牛乳房炎就顯得尤為重要。鏈球菌是導(dǎo)致牛乳腺炎較常見(jiàn)的細(xì)菌，在自然界分布廣泛，于健康奶牛的皮膚、牛奶及乳房?jī)?nèi)均可分離到該類這些細(xì)菌。

本實(shí)驗(yàn)主要對(duì)北疆地區(qū)石河子、奎屯、克拉瑪依等地區(qū)14個(gè)規(guī)?；膛?chǎng)臨床型乳房炎進(jìn)行病原的細(xì)菌學(xué)調(diào)查，再對(duì)分離出的101株鏈球菌進(jìn)行種屬的生化鑒定。而酶學(xué)活性測(cè)定是酶學(xué)研究，細(xì)菌分類的關(guān)鍵，其中的產(chǎn)α－半乳糖苷酶活性測(cè)定按伯杰細(xì)菌［3］分類中鑒定鏈球菌是必不可少的關(guān)鍵步驟之一。因而，有必要探索出在畜牧獸醫(yī)方面檢測(cè)α－半乳糖苷酶活性測(cè)定的方法。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 菌種

101株鏈球菌從北疆地區(qū)奶牛場(chǎng)臨床型乳房炎乳樣中分離、純化而得到；α－半乳糖苷酶陽(yáng)性菌株（酵母菌、屎腸球菌、黑曲霉），購(gòu)自國(guó)家獸醫(yī)微生物菌種保藏中心（CVCC）。

對(duì)硝基酚α－D－吡喃半乳糖苷（pNP－α－Gal），（批號(hào)：10646）購(gòu)于Sigma公司（美國(guó)）；美國(guó)伯樂(lè)550酶標(biāo)儀。

1．1．3 試驗(yàn)溶液

醋酸鈉緩沖液（0．05mol／L、pH 值為5．5）：A液為稱取3個(gè)結(jié)晶水的醋酸鈉0．680g定容至100 mL，B液為吸取冰醋酸0．3mL定容至100mL。用B液調(diào)節(jié)A液pH值為5．5。

對(duì)硝基酚－α－D－吡喃半乳糖苷溶液［4］（10mmol／L）：稱取0．068g對(duì)硝基酚α－D－吡喃半乳糖苷，用醋酸鈉緩沖液（0．05mol／L、pH 值5．5）溶解，置于盛有10mL蒸餾水的棕色試劑瓶中，于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

將新鮮的培養(yǎng)好的101株鏈球菌中，每管分別加入無(wú)菌生理鹽水（冷卻至室溫）3mL左右，制備成菌懸液。

1．2 方法

1．2．1 測(cè)定方法

吸取100μL制備好的菌懸液，置于微量酶標(biāo)板孔上，在405nm波段上測(cè)定其吸光度（OD值）作為本底值，同樣用移液排槍一并吸入100μL底物液與菌懸液100μL（1∶1）充分混合并振蕩，在酶標(biāo)儀405 nm波段上再次測(cè)定其吸光度（OD值），對(duì)101株鏈球菌測(cè)定OD值（均設(shè)陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照）。

1．2．2 不同鏈球菌培養(yǎng)基對(duì)酶促反應(yīng)的影響

手術(shù)完畢后仔細(xì)檢查甲狀旁腺，同時(shí)根據(jù)具體情況進(jìn)行以下處理：(1)對(duì)可疑的甲狀旁腺組織，切取部分送術(shù)中冰凍，確認(rèn)為旁腺后自體移植。(2)如甲狀旁腺血供良好，呈淡黃色或棕色，行原位保留。(3)如甲狀旁腺變?yōu)榘底仙?，用注射器針頭穿刺或尖刀片切開(kāi)其包膜，如顏色仍無(wú)好轉(zhuǎn)，及時(shí)切除后行自體移植。(4)明確為誤切的甲狀旁腺行自體移植。移植方法為：將甲狀旁腺切成約1 mm大小組織塊移植于同側(cè)的胸鎖乳突肌或帶狀肌內(nèi)。

將待測(cè)菌株分別接入血斜面培養(yǎng)基、API STREP培養(yǎng)基和鏈球菌選擇性培養(yǎng)基，按1．2．1中的測(cè)定方法，分別測(cè)定3次，取其平均值。

1．2．3 不同產(chǎn)α－半乳糖苷酶陽(yáng)性菌株的比較

選用培養(yǎng)基：將產(chǎn)α－半乳糖苷酶的陽(yáng)性菌酵母菌和屎腸球菌接種于所選適宜的培養(yǎng)基，按1．2．1中的測(cè)定方法，分別測(cè)定3次，取其平均值。

1．2．4 酶促反應(yīng)時(shí)間進(jìn)程對(duì)產(chǎn)α－半乳糖苷酶活性的影響

按1．2．1將反應(yīng)液［5］（100μL底物液與100μL菌懸液比例1∶1）充分混合振蕩后，反應(yīng)液于40℃下分別選擇合適的時(shí)間間隔保溫，測(cè)定產(chǎn)α－半乳糖苷酶菌株的吸光值，分別測(cè)定3次，取其平均值。

1．2．5 反應(yīng)體系pH值對(duì)α－半乳糖苷酶活性的影響

用冰乙酸和氫氧化納溶液配制pH值從4．5到7．5，級(jí)差為1的緩沖液。用級(jí)差不同pH值的緩沖液制備對(duì)硝基酚α－D－吡喃半乳糖苷溶液，制備底物液并且再次測(cè)定其pH值，然后根據(jù)1．2．1中的測(cè)定方法測(cè)定吸光值，分別測(cè)定3次，取其平均值。

2 結(jié)果與分析

2．1 產(chǎn)α－半乳糖苷酶陽(yáng)性鏈球菌的檢出率

對(duì)101株鏈球菌隨機(jī)分為A、B、C、D、E五組，按1．2．1的方法測(cè)定（當(dāng)所測(cè)定鏈球菌的OD值大于陰性對(duì)照擬判定為產(chǎn)α－半乳糖苷酶的陽(yáng)性鏈球菌，當(dāng)所測(cè)定鏈球菌的OD值小于陰性對(duì)照擬判定為產(chǎn)α－半乳糖苷酶的陰性鏈球菌）。結(jié)果（表1）表明，對(duì)于造成奶牛乳房炎主要病原菌之一的鏈球菌，每一組均有產(chǎn)α－半乳糖苷酶陽(yáng)性鏈球菌的菌株，且比例較高。

表1 產(chǎn)α－半乳糖苷酶陽(yáng)性檢出率Tab．1The results ofα－Galactosidase positive rate

2．2 不同鏈球菌培養(yǎng)基對(duì)酶促反應(yīng)的影響

將101株鏈球菌接種于API STREP培養(yǎng)基中，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)鏈球菌的生長(zhǎng)較為貧瘠、散落，鏈球菌菌量很少，對(duì)于測(cè)定產(chǎn)α－半乳糖苷酶鏈球菌的方法和判斷都會(huì)造成影響，故棄用。

菌株在鏈球菌選擇性培養(yǎng)基上生長(zhǎng)飽滿、密集，鏈球菌菌量較足，避免了血斜面培養(yǎng)基血液中的一些物質(zhì)對(duì)產(chǎn)α－半乳糖苷酶造成的干擾。因此，本實(shí)驗(yàn)選用鏈球菌選擇性培養(yǎng)基做為首選培養(yǎng)基。圖1顯示，含有血斜面的培養(yǎng)基比鏈球菌選擇性培養(yǎng)基的OD值差異顯著（P＜0．05）。

圖1 不同培養(yǎng)基對(duì)產(chǎn)α半乳糖苷酶的酶促反應(yīng)的影響Fig．1The influence of different culture medium to enzymatic reaction ofα－Galactosidase

2．3 不同產(chǎn)α－半乳糖苷酶陽(yáng)性菌株的選擇

圖2顯示，產(chǎn)α－半乳糖苷酶陽(yáng)性菌株的酵母菌比屎腸球菌OD值差異顯著（P＜0．05）（由于黑曲霉［5］對(duì)生物安全的危害較大，故未檢測(cè)），因此篩選出的酵母菌為產(chǎn)α－半乳糖苷酶標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性菌株。

圖2 不同產(chǎn)α－半乳糖苷酶陽(yáng)性菌株的比較Fig．2The results of comparison positive different isolates producingα

2．4 酶促反應(yīng)時(shí)間進(jìn)程對(duì)產(chǎn)α－半乳糖苷酶活性的影響

圖3顯示，反應(yīng)開(kāi)始前2～10min反應(yīng)速度最快，10min時(shí)吸光值為0．406，達(dá)到最高，之后反應(yīng)速度減緩，酶活力下降，20min時(shí)降至最低，隨后趨于平緩。

圖3 酶－底物作用的時(shí)間對(duì)酶活的影響Fig．3The time of enzyme－substrate response to enzyme live influence

2．5 反應(yīng)體系pH值對(duì)α－半乳糖苷酶活性的影響

圖4顯示，α－半乳糖苷酶的最適pH值為5．5，α－半乳糖苷酶在一定的pH范圍內(nèi)（4．5～7．0）保持相當(dāng)?shù)幕钚浴?/p>

圖4 反應(yīng)體系pH值對(duì)α－半乳糖苷酶活性的影響Fig．4The influence ofα－Galactosidase to the pH value

3 討論

通過(guò)對(duì)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析，發(fā)現(xiàn)影響α－半乳糖苷酶活力的因素為：酶－底物的反應(yīng)條件（pH、菌株、使用時(shí)間）、鏈球菌生長(zhǎng)周期、選擇性鏈球菌的培養(yǎng)基、緩沖液的配制、底物溶解度和底物溶液的濃度。這些因素將直接或間接影響酶－底物的酶促反應(yīng)的結(jié)果。

鏈球菌對(duì)生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)環(huán)境要求較高，有明顯的溶血現(xiàn)象［2］，且血液中含有各種蛋白質(zhì)、酶的誘導(dǎo)劑和頡抗劑、礦物質(zhì)等。為避免以上因素對(duì)α－半乳糖苷酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果判定和測(cè)定方法的干擾，棄用血斜面培養(yǎng)基。

酶促反應(yīng)的限速步驟一般為一級(jí)反應(yīng)或二級(jí)反應(yīng)的速度，而且初始反應(yīng)物濃度較高，有利于反應(yīng)的正向進(jìn)行，因而在反應(yīng)初期表現(xiàn)為速度較快，也正是表征酶活力的關(guān)鍵參數(shù)。故此反應(yīng)時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，為了提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性，本底值宜選擇較小值。

酶促反應(yīng)所用的緩沖溶液也會(huì)直接影響到酶的活力。緩沖液的pH值則因不同產(chǎn)α－半乳糖苷酶的菌株的不同而異。pH值不僅影響酶分子的空間構(gòu)像，也會(huì)影響底物分子的解離狀態(tài)，測(cè)定酶活力時(shí)通常用pH值恒定的緩沖溶液。李孝輝等［8］指出，pH在5．0～6．5時(shí)α－半乳糖苷酶活性比較穩(wěn)定。對(duì)于從北疆地區(qū)奶牛乳房炎樣品中分離出來(lái)的主要病原菌之一鏈球菌，產(chǎn)α－半乳糖苷酶活力最佳時(shí)反應(yīng)體系的pH 值5．5為最佳，在pH（4．5～7．0）值較寬范圍均能保持相當(dāng)?shù)幕钚浴?/p>

目前，關(guān)于測(cè)定α－半乳糖苷酶與底物pNP－α－Gal作用所需的時(shí)間，報(bào)道不一［8－10］。本實(shí)驗(yàn)測(cè)定α－半乳糖苷酶活力最佳時(shí)間為10min，同文獻(xiàn)［4，8］的結(jié)果一致。

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