張 博, 陳松林

(1. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院 黃海水產(chǎn)研究所, 農(nóng)業(yè)部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點開放實驗室, 山東 青島 266071;2. 上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院, 上海 201300)

近10年魚類細胞培養(yǎng)研究進展及應(yīng)用展望

Decades of researching progresses of fish cell culture and its application prospects

張 博1,2, 陳松林1

(1. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院 黃海水產(chǎn)研究所, 農(nóng)業(yè)部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點開放實驗室, 山東 青島 266071;2. 上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院, 上海 201300)

魚類細胞培養(yǎng)作為一種重要的研究手段, 廣泛應(yīng)用于病毒學(xué)、環(huán)境毒理學(xué)、細胞生物學(xué)、腫瘤學(xué)、基因組學(xué)、遺傳學(xué)以及資源保護等方面的研究。魚類細胞作為實驗對象, 有著活體魚無法比擬的優(yōu)點：(1) 成本低, 細胞系的維護不需要大型的養(yǎng)殖設(shè)備和大量的換水與充氣; (2)重復(fù)性好, 實驗條件可以精確控制。因此, 對魚類細胞系進行深入研究, 無論在理論研究方面, 還是在實際應(yīng)用方面, 都具有深遠意義。作者對魚類細胞培養(yǎng)方法與技術(shù)、魚類細胞培養(yǎng)研究進展、魚類細胞系應(yīng)用和前景展望進行全面系統(tǒng)的綜述。

1 魚類細胞培養(yǎng)方法

魚類細胞的培養(yǎng)方法包括原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)。魚類細胞原代培養(yǎng)的方法包括組織塊培養(yǎng)法、機械分離法、絡(luò)合劑分散法、消化分散法、懸浮細胞培養(yǎng)法、微載體細胞培養(yǎng)法等等。以上幾種方法常?？梢耘浜鲜褂? 如機械分散法可以同時和酶消化法、絡(luò)合劑分散法使用, 既使用機械分離又使用化學(xué)分離, 摸索一個既能有效地分離細胞又對細胞損傷最小的契合點。絡(luò)合劑可以絡(luò)合對消化酶有抑制作用的金屬離子, 從而更好發(fā)揮酶的作用。懸浮培養(yǎng)主要用于培養(yǎng)如淋巴細胞、部分腫瘤細胞, 同時需要輔以搖床振蕩或者攪拌, 以保持細胞均勻的分散在培養(yǎng)基中。微載體培養(yǎng)法需要借助微載體來提高細胞產(chǎn)量, 該技術(shù)需要生物反應(yīng)設(shè)備, 適合自動化規(guī)?；a(chǎn)[1]。魚類細胞培養(yǎng)具有得天獨厚的條件： 魚類細胞培養(yǎng)對傳代培養(yǎng)時間、培養(yǎng)溫度范圍、培養(yǎng)基的選擇范圍等條件都較哺乳類靈活, 取材更加廣泛： 如胚胎組織和幼魚的各種組織分化程度低, 分裂潛能大, 是原代培養(yǎng)的主要組織來源, 更有優(yōu)勢的是成體魚的性腺、頭腎、后腎、心臟、鰓、鰾、脾臟、鰭條、眼、尾干等組織以及成魚的腫瘤組織也是常用材料, 并且并不會因為魚類成年而降低細胞的分裂能力, 魚類細胞平均傳代 100代仍可以繼續(xù)分裂, 比起哺乳類, 魚類的有絲分裂極限要大得多, 并且魚類細胞系每一代細胞的存活期均較長;人和哺乳動物離體培養(yǎng)的正常二倍體細胞株壽命均有限, 一般不超過50代。

2 魚類細胞培養(yǎng)研究進展

2.1 國外魚類細胞系建立狀況

自20世紀60年代, Wolf等[2]建立了世界上第一個魚類細胞系——虹鱒(Oncorhynchus mykiss)魚生殖腺細胞系 RTG-2以來, 魚類的細胞培養(yǎng)研究進展十分迅速。至2010年, 全世界已報道建立的魚類細胞系約有 275類, 其中大多數(shù)來自淡水魚或溯河產(chǎn)卵的海洋魚類。淡水魚類和溯河洄游性魚類約175株,分別來源于 71個科的 89種魚類的不同組織; 而海水魚類及咸水魚類的細胞系僅有約 100株, 分別來源于 23個科的 35種海水魚類的不同組織[3]。國外魚類細胞研究較國內(nèi)要早很多, 尤其是研究較為領(lǐng)先的美國和北歐的國家。近10 年來, 國外魚類細胞系的建立和應(yīng)用研究很活躍。陸續(xù)建立了很多新的細胞系, 并且逐漸傾向于細胞系的應(yīng)用(表1)。

表1 近10年來國外魚類細胞系建立一覽表

2.2 國內(nèi)魚類細胞系建立狀況

中國魚類細胞培養(yǎng)的研究始于20世紀 70年代末, 隨著海水魚類養(yǎng)殖規(guī)模的發(fā)展壯大, 魚類細胞系的建立和應(yīng)用范圍也越來越大, 截止到2010年上半年, 國內(nèi)已經(jīng)建立的魚類細胞系約 70種, 主要來自40多種魚類, 來源的組織有吻端、腎臟、卵巢、尾鰭、膘、性腺、肝臟、胚胎、囊胚、原腸胚、鰭條等(表 2)。

3 魚類細胞系的主要應(yīng)用

新世紀伊始, 魚類細胞培養(yǎng)發(fā)展更為迅速, 并且日益發(fā)揮出它的作用, 具體表現(xiàn)在以下幾個方面：(1) 建立的細胞系大量增加; (2) 涉及面拓寬、拓廣,不僅表現(xiàn)在細胞系隸屬魚類的品種增加, 由淡水魚擴展到海水魚類, 由魚類擴展到細胞培養(yǎng)的難點——甲殼類和海產(chǎn)貝類, 而且組織來源更廣泛, 其中一些腫瘤細胞和癌細胞系的建立更受人關(guān)注; (3) 魚類細胞系的應(yīng)用更廣泛, 已由單純的病毒分離、免疫學(xué)、毒理學(xué)、致癌作用、遺傳學(xué)研究逐步向近些年研究很集中的基因組學(xué)、DNA的復(fù)制與修飾、表觀遺傳學(xué)、基因敲除、RNAi以及最新的iPS等各個方面發(fā)展, 相信未來的一段時間, 細胞系這個重要平臺和工具將發(fā)揮出更加重要的作用。

表2 近10年來國內(nèi)魚類細胞系建立一覽表

3.1 魚類病毒學(xué)的研究

魚類病毒的分離在細胞系建立之前一直是困擾生物學(xué)家的難題。迄今已發(fā)現(xiàn)的近60種魚類病毒中,有 9種病毒對漁業(yè)生產(chǎn)有嚴重的影響, 它們是： 雙RNA病毒科(Birnaviridae)的傳染性胰壞死病毒(Infectious pancreatic necrosis virus), 虹彩病毒科(Iridoviridae)的虹彩病毒(Iridovirus)、棒狀病毒科(Baculoviridae)的雙鏈DNA棒狀病毒(ds DNA baculovirus)、呼腸病毒科(Reoviridae)的草魚呼腸病毒(Grass carp reovirus), 野田病毒科(Nodaviridae)的野田病毒(Nodamura virus)、彈狀病毒科(Rhabdoviridae)的鯉魚春季病毒血癥病毒(Rhabdovirus carpio)、彈狀病毒科的病毒性出血性敗血癥病毒(Viral hemorrhagic septice-mia virus)、彈狀病毒科的傳染性造血器官壞死病毒(Infectious haematopoietic necrosis virus)和彈狀病毒科的白斑狗魚幼魚彈狀病毒(Pike fry rhabdovirus)。近些年來病毒的研究已經(jīng)越來越趨向于成熟。Chang等[21]用建立了亞洲鱸魚幼魚細胞系分別感染虹彩病毒(iridovirus)、博爾納病毒(Borna disease virus)、呼腸病毒科的呼腸病毒(Reovirus)、傳染性胰壞死病毒、棒狀病毒和野田病毒, 結(jié)果顯示感染后均表現(xiàn)出明顯的病理學(xué)效應(yīng), 且其中的呼腸病毒科的呼腸病毒、傳染性胰壞死病毒、棒狀病毒在細胞系中的復(fù)制效率最高, 可以用作病毒擴繁。Qin等[39]2005年建立了斜帶石斑魚脾臟細胞系, 并用已經(jīng)建立的細胞系感染虹彩病毒和野天村病毒： 感染新加坡鯰魚虹彩病毒和野天村病毒的細胞系表現(xiàn)出很好的病理學(xué)效應(yīng), 應(yīng)用透射電子顯微鏡和免疫熒光顯微鏡觀察顯示細胞系對兩種病毒都有著很高的敏感性, 暗示了這個細胞系可以作為這兩種病毒的分離及繁殖的有力工具。Parameswaran等[10]建立了虱目魚的心臟細胞系和斜帶石斑魚的眼細胞系, 并將建立的細胞系感染包括野田病毒、海洋伯爾納病毒(Marine birnavirus)NC1和Y-6、3種雙RNA病毒科的傳染性胰壞死病毒((IPNV) (VR 299, SP和AB)、海勒姆棒狀病毒(Hirame rhabdovirus)(CA 9703)從細胞病理學(xué)效應(yīng)分析評價了該細胞系對于 7種不同病毒的敏感性。Wen等[39]建立了斜帶石斑魚的腦組織細胞系GBC1和GBC4并用于病毒敏感性實驗, 發(fā)現(xiàn)前者對于神經(jīng)壞死病毒(GNNV)高度敏感, 但對于花鱸虹彩病毒(GSIV)不敏感而后者的結(jié)果正好相反。Mx蛋白誘導(dǎo)的GNNV感染只發(fā)生在GBC4, 暗示了Mx蛋白可能抑制RNA的合成。beta野田科病毒過去一直被認為只能在魚類細胞中增殖, 然而日本學(xué)者Takizawa等[52]發(fā)現(xiàn)紅石斑魚神經(jīng)壞死病毒可以在大鼠的星細胞瘤細胞系中擴增繁殖, 這是首次發(fā)現(xiàn)beta野田科病毒在哺乳動物細胞系中的增殖, 這將有助于闡明beta野田科病毒宿主專一性的機制。Kim等[53]報道了對2005年肆虐韓國的褐牙鲆病魚取樣進行分析的研究結(jié)果。盡管沒有分離出任何細菌病毒但用病魚的組織濾除液感染FHM,CHSE-214以及FSP細胞系還是發(fā)現(xiàn)細胞病理學(xué)效應(yīng), 通過 PCR檢測及核苷酸序列比對最終確定病原為濾過性病毒引起的出血性敗血病?？梢娎眉毎底鳛楣ぞ? 對于病原檢測的重要意義。Ku等[14]建立了玳瑁石斑魚腦、鰓、心臟3個細胞系, 進行了病毒及細胞毒素敏感性的實驗, 發(fā)現(xiàn) 3種細胞系對于不同病毒和毒素的敏感性存在明顯的差異, 同時轉(zhuǎn)入了 pEGFP-C3基因進行了轉(zhuǎn)基因效率的研究。

似乎細胞系的建立與病毒分離的研究已經(jīng)很成熟, 但是這僅僅存在于魚類中, 而對于對蝦病毒的分離則一直是一個挑戰(zhàn)性的題目, 迄今, 屢經(jīng)嘗試也尚未建立一個永久性的對蝦細胞系, 如果能建立對蝦的永久性細胞系用于對蝦的白斑病毒的分離及相關(guān)的抗病毒藥物篩選研究, 將會在很大程度上促進對蝦病毒病的研究工作,而這將是未來一段時間一個焦點課題。

3.2 魚類細胞疫苗制備

魚類雖然是低級脊椎動物, 但它仍有較為完善的免疫系統(tǒng), 研究表明, 魚類的腎、脾、胸腺和消化道的淋巴組織, 以及血液、淋巴液都是產(chǎn)生免疫應(yīng)答的主要器官和組織, 它和人類一樣具有 T淋巴細胞和 B淋巴細胞, 這是免疫應(yīng)答過程中起核心作用的淋巴細胞。傳統(tǒng)的預(yù)防魚類疾病的方式是利用化學(xué)藥物和抗生素來控制病害的泛監(jiān), 但長期使用抗生素使病菌的抗藥性越來越強, 并且大量的藥物殘留嚴重破壞了生態(tài)環(huán)境, 水生有益菌嚴重失調(diào), 食用魚的安全性也受到了影響, 探索新型、有效的魚病免疫防治技術(shù)已迫在眉睫?？诜呙缡菍κ苊庖邉游镆鹱钚?yīng)激的免疫途徑, 研制草魚轉(zhuǎn)基因植物疫苗具有重要科學(xué)意義和應(yīng)用價值。樊廷俊等[49]2007年建立大菱鲆鰭細胞系, 研究了胰蛋白酶、透明質(zhì)酸酶和Ⅱ型膠原酶消化法啟動大菱鲆鰭組織的原代培養(yǎng)的區(qū)別, 并通過培養(yǎng)液配方和培養(yǎng)條件的優(yōu)化成功進行大菱鲆鰭細胞的繼代培養(yǎng)。該細胞系的建立對于查清病毒對大菱鲆細胞的感染途徑與感染機理等具有重要的理論意義, 對于病毒疫苗研制具有重要應(yīng)用價值。

3.3 環(huán)境毒物和污染物檢測

魚類養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展與工農(nóng)業(yè)污染對水質(zhì)的破壞, 客觀上要求魚類毒理學(xué)的研究與發(fā)展的深入。利用體外培養(yǎng)魚類細胞對環(huán)境毒物, 包括誘變劑、致癌物、環(huán)境激素和內(nèi)分泌干擾素、重金屬離子、工業(yè)廢水中的有機污染物進行污染監(jiān)測和安全性評價,是魚類細胞培養(yǎng)的重要用途之一。近10年來這方面的應(yīng)用有了新的發(fā)展。泰國的Pornsawan等[9]通過建立的雜交鯰魚(尖齒胡鯰×斑點胡鯰)3種組織的細胞系進行了細胞毒理學(xué)實驗, 對比了氫氧化三苯錫對雜交鯰魚尾干、腮和肝臟細胞系的毒理學(xué)影響, 確定了相關(guān)的標準。Zhou等[54]利用培養(yǎng)的羅非魚鰓上皮細胞來檢測海水中甲狀腺旁激素及二氧化物等污染物。實驗顯示該細胞對污染物表現(xiàn)出很好的敏感性,因此認為該細胞可以作為很好的環(huán)境檢測工具。Davorena等[55]進行了河口沉積物對3種魚類細胞系(CHSE, EPC and RTG-2)生態(tài)毒理學(xué)的評估, 分別從細胞毒素產(chǎn)生、細胞生存繁殖能力、主要細胞器(溶酶體、線粒體)的形態(tài)觀察幾個方面分析了沉積物中對細胞系的影響, 發(fā)現(xiàn) RTG-2細胞對沉積物的反應(yīng)最為敏感。韓國的Woo等[56]用慧星拖尾技術(shù)檢測了海底沉積物和稠環(huán)芳烴對于牙鲆血細胞的影響, 研究發(fā)現(xiàn)沉積物提取物及稠環(huán)芳烴的量、血細胞暴露在二者中的時間與牙鲆血細胞單鏈DNA的破損程度成正相關(guān)。國內(nèi)張士璀等近年來利用牙鲆細胞系在典型污染物毒性檢測上做了大量的工作。Qin等[57]利用體外培養(yǎng)的牙鲆鰓細胞系探討了壬基酚對牙鲆鰓細胞的毒性影響, 發(fā)現(xiàn)此類環(huán)境激素可以降低鰓細胞抗氧化酶活性, 使胞內(nèi)的 O2-水平升高, 超微結(jié)構(gòu)也發(fā)生了改變。Zhang等[58]、Su 等[59]和 Li等[60]利用中性紅染色法、MTT細胞記數(shù)法和細胞蛋白檢測法 3種方法檢測了有機磷農(nóng)藥、有機錫化合物對牙鲆鰓細胞系(FG)的影響, 摸索到了最低毒害劑量,并從超微結(jié)構(gòu)揭示了有機磷對細胞內(nèi)典型細胞器的破壞作用。Na等[61]比較了一種殺螨劑對于牙鲆及其鰓細胞系(FG)毒性的影響, 實驗發(fā)現(xiàn)二者都對殺螨劑的毒性效應(yīng)比較敏感, 并且長時間的毒性作用與短時間作用對于二者都沒有更顯著的差異, 鰓和肝組織是對毒性最敏感的組織, 因此得出結(jié)論： FG細胞系能夠在體外很好地評價殺螨劑對于牙鲆的毒性影響?？梢娨院Ｋ~類細胞系作為環(huán)境污染和毒物檢測工具有廣闊的應(yīng)用前景, 對于環(huán)境評估和檢測有重要意義。

3.4 基因篩選與功能分析

細胞系還是進行基因功能分析的理想材料, 而對魚類免疫基因功能的發(fā)掘意義重大。魚類是特異性免疫系統(tǒng)和非特異性系統(tǒng)并存的脊椎動物, 在魚類對外界刺激及病原生物侵襲的防御反應(yīng)中, 非特異性免疫起著重要作用。近年來有關(guān)魚類非特異性相關(guān)功能基因組的克隆及免疫調(diào)節(jié)機理的研究已成為研究熱點, 已知的非特異性免疫防病相關(guān)因子中,魚類抗菌肽、白細胞介素、干擾素、干擾素調(diào)節(jié)因子(interferon regulatory factors, 簡稱IRF)、轉(zhuǎn)化生長因子 β(transfomaing growth factor β, 簡稱 TGF-β)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α, 簡稱TNF-α)、趨化因子(chemokine)、NK 細胞增強因子(NK cell enhancement factor, 簡稱 NKEF)主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex, 簡稱 MHC)包括MHC I和Ⅱ等基因克隆的研究, 已經(jīng)在斑馬魚(Brachydanio rerio)、鯉魚(Cyprinus carpio)、草魚(Ctenopharyngodon idella)、白鱸(Morone chrysops)、虹鱒(Oncorhynchus mykiss)、牙鲆(Paralichthys olivaceus)、大菱鲆(Scophthalmus maximus)等多種魚類上報道過, 但是其免疫功能在魚類細胞中的驗證目前為止還鮮有報道。只有 Ryosuke等[62]將牙鲆的腫瘤壞死因子基因連鎖GFP熒光蛋白表達基因?qū)虢?jīng)LPS孵育的牙鲆腎臟細胞(YO-K)和牙鲆胚胎細胞(HINAE)。結(jié)果顯示在LPS的誘導(dǎo)1 h后GFP的表達在兩種細胞中都增強, 而3～6 h后在YO-K中表達逐漸減弱, 而在HINAE中仍舊增強。實驗結(jié)果表明腫瘤壞死因子的啟動子受免疫系統(tǒng)的調(diào)控。

RNAi是由 dsRNA介導(dǎo)的由特定酶參與的特異性基因沉默現(xiàn)象, 它在轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平和翻譯水平上阻斷基因的表達。已有研究表明RNAi能夠在哺乳動物中滅活或降低特異性基因的表達, 產(chǎn)生類似基因敲除的效應(yīng), 這對于分析研究基因功能具有重要的應(yīng)用價值。目前 RNAi在非脊椎動物如線蟲,果蠅, 以及植物中的應(yīng)用已經(jīng)取得了很多重要的成果, 但是在魚類的研究中還應(yīng)用較少, 未來可能在魚類相關(guān)基因篩選和功能分析方面會有廣泛的應(yīng)用。最近臺灣學(xué)者 Wu等[63]通過在澳洲肺魚的腦細胞系中應(yīng)用RNAi技術(shù)研究了澳洲肺魚Mx蛋白抵抗神經(jīng)壞死病毒(NNV)的作用機制, 發(fā)現(xiàn)Mx蛋白是通過抑制 NVV的 RNA合成酶(RdRp)從而阻斷病毒RNA的合成來實現(xiàn)其抗病毒作用的。這也是國內(nèi)應(yīng)用魚類細胞系進行RNAi干擾的最新嘗試。

3.5 魚類腫瘤研究

培養(yǎng)魚類的癌細胞是研究腫瘤發(fā)生、篩選抗腫瘤藥物的重要途徑之一。魚類實驗動物在實驗?zāi)[瘤學(xué), 尤其是其中的比較腫瘤學(xué)和從環(huán)境毒理學(xué)角度探索疑致癌物等研究中發(fā)揮著重要的作用。魚類腫瘤細胞極度增生, 增生細胞常形成腫塊, 且具異常結(jié)構(gòu)與功能, 代謝和生長能力非常旺盛, 這些典型的腫瘤癥狀暗示了魚類動物細胞是作為腫瘤研究的理想模型。魚類細胞用于腫瘤學(xué)領(lǐng)域已經(jīng)做了大量的工作并且也取得了一定的成績。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)淡水魚類機體的所有組織都會發(fā)生癌性病變, 而海水魚則不盡然。例如我們熟知的鯊魚就從未發(fā)現(xiàn)癌變。陳莉等[64]利用腫瘤細胞系研究了鯊魚軟骨的抗癌作用,實驗證明： 鯊魚軟骨制劑確實對于腫瘤細胞具有抑制作用。于秋濤等[65]也曾將嘗試建立鯊魚的軟骨細胞系, 目的也是為了更好地研究抗腫瘤的機制及帥選抗腫瘤藥物。如果能夠建立起鯊魚的軟骨細胞系,那么將在很大程度上促進腫瘤學(xué)的研究。

3.6 魚類免疫調(diào)節(jié)機制研究

Shen等[66]從淡水鯰魚中分離出第一個變溫動物的細胞毒細胞系, 研究了 T淋巴細胞和自然殺傷細胞的作用機制。實驗證明, 鯰魚有一系列不同的細胞毒細胞。2003年 Chisato等[22]通過建立的狼鱸胚胎細胞系感染支原體來研究上皮樣細胞表面病原和宿主的相互作用。2003年Meng等[67]以草魚體外培養(yǎng)的頭腎巨噬細胞為模型, 探討了多種人工合成的寡核苷酸序列和兩種不同細菌的基因組DNA對巨噬細胞活化的作用。實驗發(fā)現(xiàn)含有CpG的寡脫氧核糖核苷酸序列(ODNs)和細菌 DNA都能引起巨噬細胞的活化, 說明CpG DNA在增強魚類細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)方面有重要的作用。作為一種新型有效的免疫調(diào)節(jié)劑, 它能增強魚體內(nèi)細胞和體液介導(dǎo)的免疫應(yīng)答,從而增強機體的抗病能力。挪威學(xué)者Eirin等[23]建立了一個取自大西洋鮭腎臟的吞噬細胞系(TO), 并且通過細胞酶學(xué)、單克隆抗體、特異免疫基因表達、real-time RT-PCR等技術(shù)鑒定了這個具有免疫功能的細胞系, 該細胞系對于研究魚類細胞免疫功能具有重要意義。

3.7 魚類組織工程

魚類胚胎干細胞的研究主要集中在魚類胚胎干細胞的培養(yǎng)、魚類胚胎干細胞的體外分化能力、魚類胚胎細胞的移植及嵌合體的制作和基因打靶技術(shù)等方面。魚類胚胎干細胞和基因打靶技術(shù)的研究目前在中國乃至國際上還處于起步階段。盡管已經(jīng)獲得了斑馬魚和青鳉(Oryzias latipes)的ES樣細胞, 也獲得了青鳉干細胞移植的嵌合體, 但是迄今還沒有獲得能夠傳遞給后代的生殖系嵌合體, 這就需要對基因打靶技術(shù)進行深入的研究, Hong[68]和Chen等[69]率先開展了魚類胚胎干細胞和基因打靶的研究, 建立了永久性花鱸胚胎干細胞系 LJESI,鳉構(gòu)建了青P53和真鯛脂肪酶的基因打靶載體, 并進行了基因打靶實驗[70]?；虼虬屑夹g(shù)逐漸成為魚類胚胎干細胞研究的熱點, 可以預(yù)見, 胚胎干細胞研究和基因打靶技術(shù)將在魚類發(fā)育生物學(xué)、魚類基因工程育種及海洋生物技術(shù)等方面發(fā)揮很大的作用。隨著海水魚類養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展, 海水魚類細胞培養(yǎng)的研究逐漸得到重視。從20世紀晚期開始, 中國啟動了海洋863計劃, 新世紀伊始, 將海水魚類細胞培養(yǎng)和細胞系建立列為國家863課題。自此, 中國海水魚類細胞培養(yǎng)的工作逐步開展起來。童裳亮等[71]于1997年建立了牙鲆鰓等4種永生細胞系, 這為研究牙鲆、鱸魚和真鯛提供了研究材料。近 5 年多來在海水鲆鰈魚類細胞培養(yǎng)和海水魚類細胞庫建立方面取得明顯進展。Chen等[69]率先建立了花鱸(Lateolabrax japonicus)胚胎干細胞系, 這也是中國第一個魚類胚胎干細胞系, 在體外將花鱸胚胎干細胞系誘導(dǎo)成肌肉細胞、神經(jīng)細胞和黑色素細胞等不同細胞類型, 隨后 Chen等[34]又建立了真鯛胚胎干細胞系, 并表明在體外具有分化成不同細胞的能力。Chen等[42]在鱸魚和真鯛胚胎干細胞系的基礎(chǔ)上, 將綠色熒光蛋白基因(GFP)轉(zhuǎn)移到花鱸胚胎干細胞中, 建立了表達 GFP的花鱸胚胎干細胞株, 同時還建立了胚胎干細胞移植技術(shù), 獲得了GFP標記的胚胎干細胞移植的鱸魚和斑馬魚胚胎和魚苗。另外, 還構(gòu)建了鱸魚生長抑素基因的同源重組載體, 并建立了魚類細胞基因打靶的正負選擇策略和技術(shù)條件, 在國際上也占有一席之地。任國誠等[45]以漠斑牙鲆囊胚期胚胎為材料建立漠斑牙鲆胚胎細胞系, 傳至 80 多代, 通過脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法將GFP 報告基因轉(zhuǎn)入 SFEC中, 獲得成功表達,轉(zhuǎn)化率為 20%。最近任國誠等[35]建立的半滑舌鰨肝臟細胞系(HTLC), 該細胞系經(jīng)過 200多天的培養(yǎng), 已成功傳代30多代, 檢測了溫度、胎牛血清濃度、成纖維生長因子對HTLC生長的影響, 將GFP報告基因通過脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)入 HTLC中并成功地獲得了表達。

4 魚類細胞培養(yǎng)展望

魚類細胞系的研究未來仍然有巨大的發(fā)展空間。作為一個良好的平臺, 近些年逐步向研究很集中的熱點學(xué)科如基因組學(xué)、DNA的復(fù)制與修飾、表觀遺傳學(xué)、基因敲除、RNAi以及最新的iPS技術(shù)等各個方面發(fā)展, 例如它可以結(jié)合RNAi技術(shù)研究基因功能, 通過 RNA干擾技術(shù), 采用細胞模型可以分析基因的功能。RNAi技術(shù)在發(fā)掘和分析功能基因上無疑是有力的方法, 如果結(jié)合利用細胞系作為這項技術(shù)的實驗平臺, 將其應(yīng)用到魚類免疫學(xué)的研究中, 以中國重要的海水經(jīng)濟魚類的細胞系作為實驗材料,構(gòu)建 RNA干擾表達載體, 沉默免疫功能基因, 再用外源病原(細菌、病毒)來感染細胞系, 觀察、分析免疫基因沉默與否對細胞系的影響, 驗證免疫因子的抗菌作用。這不僅可以節(jié)約大量的時間和精力, 而且在一定程度上降低了實驗的復(fù)雜度, 從而使結(jié)果更加清晰, 得到更為理想的實驗結(jié)果。此平臺的建立,可以規(guī)?；姆治?、研究基因功能, 大大加快抗病疫苗的研發(fā)。

海水魚類細胞系在海洋環(huán)境檢測方面的應(yīng)用前景也很廣泛。相對于生物個體, 細胞系對于海水中重金屬離子、有機氮磷污染物、環(huán)境激素等毒物的反應(yīng)更快、更加敏感, 相信利用海水魚類細胞系作為海洋環(huán)境檢測的工具會推動新的、更為安全的環(huán)境毒物排放標準的確立。

海水魚類細胞系對于腫瘤學(xué)的研究價值也不可小覷。海洋生物腫瘤發(fā)病率低, 典型的如鯊魚, 終身不會得腫瘤, 可能是鯊魚軟骨中有對腫瘤細胞具有抑制作用的成分。因此建立鯊魚體細胞系, 進行腫瘤學(xué)的研究將有非常重要的實用意義。

海水魚類非特異性相關(guān)功能基因的克隆及免疫調(diào)節(jié)機理的研究目前已是研究熱點, 已知的非特異性免疫相關(guān)因子基因克隆的研究已經(jīng)多有報道, 那么是否還存在其他的魚類非特異性的免疫因子, 以及其在魚類細胞中的功能分析和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的研究,都將可能成為未來應(yīng)用研究的熱點。

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Q2

A

1000-3096(2011)07-0113-09

2010-03-22;

2010-06-03

國家863項目(2006AA10A401); 山東省泰山學(xué)者工程專項經(jīng)費資助項目

張博(1985-), 男, 內(nèi)蒙古包頭人, 碩士研究生, 主要從事分子細胞生物學(xué)研究, E-mail： zb611273@163.com; 陳松林, 通信作者,研究員, 博士生導(dǎo)師, 電話： 0532-85844606; E-mail： chensl@ysfri.ac.cn

譚雪靜)