歐陽吉隆, 周永燦, 吳學(xué)貴, 戴小連, 王世鋒, 謝珍玉

(海南大學(xué) 海南省熱帶水生生物技術(shù)重點實驗室, 海南 海口 570228)

海南地區(qū)溶藻弧菌遺傳多樣性的RAPD分析

歐陽吉隆, 周永燦, 吳學(xué)貴, 戴小連, 王世鋒, 謝珍玉

(海南大學(xué) 海南省熱帶水生生物技術(shù)重點實驗室, 海南 海口 570228)

以來源于泰國的菌株TG06003作對照, 對采自海南地區(qū)的27株溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)環(huán)境菌株進行了隨機擴增多態(tài)性DNA標記(RAPD)分析, 其中6株為毒力菌株, 另外22株為非毒力菌株。實驗共得到 70個多態(tài)性條帶, 多態(tài)性比率(PPB)為 98.6%?；蚨鄻佣鹊乃阈g(shù)平均數(shù)和加權(quán)平均數(shù)分別為0.922和0.454 4, Shannon’s信息指數(shù)的算術(shù)平均數(shù)和加權(quán)平均數(shù)分別為0.139 1和0.171 3。遺傳相似度為0.442 9～0.885 7, 遺傳距離為0.121 4～0.752 0。將溶藻弧菌分為毒力菌株和非毒力菌株兩個類群進行分析, 結(jié)果表明, 毒力菌株的遺傳多樣性豐富, 它們的基因多樣度和Shannon’s信息指數(shù)明顯高于非毒力菌株; 毒力菌株HN08811、HN08155、HN08809、HN08813明顯聚為一類, 另外2株毒力菌株分別與非毒力菌株HN08304和HN08803聚為一類, 溶藻弧菌毒力菌株存在多種遺傳型。

溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus); RAPD; 毒力菌株; 遺傳多樣性

溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)屬于弧菌科(Vibrionaceae), 弧菌屬(Vibrio), 革蘭氏陰性短桿菌,是海洋及河口環(huán)境中常見細菌種類, 廣泛存在于海水養(yǎng)殖環(huán)境[1]。該菌是一種條件致病菌, 嚴重威脅著海南的海水養(yǎng)殖業(yè), 是凡納濱對蝦[2](Penaeus vannameiBoone)、鮭點石斑魚[3](Epinephelus fario)、點帶石斑魚(Epinephelus coioides)[4]、雜色鮑[5](Haliotis diversicolor)等養(yǎng)殖品種的常見細菌性病原之一。2006年至2008年間, 本實驗室人員在海南島及周邊地區(qū)的主要海水養(yǎng)殖區(qū)采集并分離了28株溶藻弧菌,經(jīng)人工感染, 確定 6株為毒力菌株, 另外22株為非毒力菌株。作者采用隨機擴增多態(tài)性 DNA標記(RAPD)技術(shù), 分析毒力菌株與非毒力菌株的遺傳多樣性, 旨在揭示溶藻弧菌毒力菌株特異遺傳型及其特異性分子標記, 為今后開展因溶藻弧菌引發(fā)的重大流行病的防治和其致病機理研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

共28株溶藻弧菌, 其中27株(表1)采自海南島,另 1株(TG06003)采自泰國, 分別為 HN08811、HN08155、HN08809、HN08813、HN08335、HN07006、HN08304、TG06003、HN08307、HN08810、HN08806、HN08803、HN08808、HN07011、HN08202、HN08801、HN07014、HN08303、HN08203、HN08805、HN08306、HN07009、HN07005、HN07002、HN08201、HN07010、HN08305、HN08807, 由本實驗室分離、鑒定及保種。鑒定方法參照謝珍玉等[6]的方法。Taq酶、dNTPs、MgCl2購自上海申能博彩公司。DNA Maker(DL2000)購自大連寶生物公司。70條RAPD引物(表2)由上海生工合成。

1.2 實驗方法

1.2.1 DNA的提取

將保種的菌株接種于2216E海水營養(yǎng)培養(yǎng)基中,35℃, 180 r/min振蕩培養(yǎng)12 h。取1.5 mL菌液4 000 r/min離心1 min, 去上清, 以1 mL無菌水洗滌細菌。細菌基因組DNA提取采用SDS裂解法[7-8], 加入50 μL TE緩沖液, 儲存于4℃冰箱備用。

1.2.2 RAPD擴增

RAPD擴增方法主要參考陳償?shù)萚9]的方法并作適當改良。擴增體系為： 0.4 μL Taq 酶(5U/μL)、1 μL dNTPs(10 mmol/L)、2.5 μL buffer (含 MgCl2)、1 μL 引物(100 μmol/L)、1 μL DNA 模板(基因組 DNA 稀釋 10倍), 加無菌水補至 25 μL。PCR 反應(yīng)在 Eppendorf Mastercycle Gradient PCR擴增儀上進行。反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性4 min, 94℃變性1 min, 36℃退火1 min,72℃延伸2 min, 40個循環(huán), 72℃繼續(xù)延伸10 min, 4℃保存。首先以 HN08811、HN08155、HN08809、HN08307、HN08810 這5株細菌基因組DNA為模板作PCR擴增, 重復(fù)3次, 篩選特異性高且重復(fù)性好的引物進一步對所有菌株基因組DNA作擴增。

表1 溶藻弧菌分離株的來源情況Tab. 1 The sources of isolated Vibio alginolyticus

表2 70條RAPD引物Tab. 2 70 RAPD primers

1.2 %瓊脂糖凝膠電泳檢測 PCR產(chǎn)物, 在凝膠成像系統(tǒng)(Universal Hood Ⅱ, Biorad)上觀察記錄實驗結(jié)果。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理

電泳圖中相同遷移位置上有條帶的記1、無條帶的記0, 以1、0數(shù)列矩陣形式記錄PCR產(chǎn)物的擴增位點。利用 popgene 32軟件對數(shù)據(jù)進行分析, 得出Nei’s基因多樣度、Shannon’s信息指數(shù)、遺傳相似度、遺傳距離等數(shù)據(jù), 并根椐遺傳距離利用Mega 4構(gòu)建UPGMA系統(tǒng)進化樹[10-12]。

2 實驗結(jié)果

2.1 RAPD引物篩選和擴增產(chǎn)物多態(tài)性

從70條引物中篩選并獲得8條特異性高且重復(fù)性好的引物, 具體見表3。引物S2103、S2084和S330的電泳指紋圖譜分別見圖1、圖2和圖3。

8條隨機引物共產(chǎn)生了 71條帶, 其中多態(tài)性條帶70條, 多態(tài)性比率為(PPB)為98.6%。平均每條引物產(chǎn)生了7.8條多態(tài)性條帶, 產(chǎn)物大小在100～2 000 bp之間。Nei’s基因多樣度的算術(shù)平均數(shù)為0.922, 加權(quán)平均數(shù)為0.454 4。Shannon’s信息指數(shù)的算術(shù)平均數(shù)為0.139 1, 加權(quán)平均數(shù)為0.171 3。遺傳相似度為0.442 9～0.885 7, 遺傳距離為 0.121 4～0.752 0。以引物 S330擴增時, 毒力菌株 HN08811、HN08155、HN08809和 HN08813基因組產(chǎn)生了分子質(zhì)量約為1 200 bp的特異性條帶。

2.2 毒力菌株和非毒力菌株的遺傳多樣性分析

毒力菌株和非毒力菌株的遺傳統(tǒng)計數(shù)據(jù)詳見表4。將毒力菌株和非毒力菌株分為兩個類群進行數(shù)據(jù)分析, 毒力菌株產(chǎn)生了 54個多態(tài)性位點, 非毒力菌株產(chǎn)生了 59個多態(tài)性位點。毒力菌株的 Nei’s基因多樣度的算術(shù)平均數(shù)與加權(quán)平均數(shù)以及Shannon’s信息指數(shù)的算術(shù)平均數(shù)與加權(quán)平均數(shù)分別為 0.301 6、0444 1、0.184 5和0.259 7, 非毒力菌株對應(yīng)的數(shù)據(jù)分別為0.255 6、0.397 4、0.162 5和0.224 6。毒力菌株的兩種Nei’s基因多樣度和兩種Shannon’s信息指數(shù)均高于非毒力菌株。毒力菌株之間的遺傳相似度為 0.514 3～0.757 1, 遺傳距離為 0.278 2～0.665 0, 非毒力菌株之間的遺傳相似度為 0.471 4～0.885 7, 遺傳距離為0.121 4～0.752 0。

表3 篩選引物名稱與擴增結(jié)果Tab. 3 The coding of primers and the amplification results

圖1 引物S2103對28株溶藻弧菌的PCR擴增結(jié)果Fig. 1 PCR amplification profiles of 28 strains of Vibrio alginolyticus by primer S2103

圖2 引物S2084對28株溶藻弧菌的PCR擴增結(jié)果Fig. 2 PCR amplification profiles of 28 strains of Vibrio alginolyticus by primer S2084

圖3 引物S330對28株溶藻弧菌的PCR擴增結(jié)果Fig. 3 PCR amplification profiles of 28 strains of Vibrio alginolyticus by primer S330

表4 溶藻弧菌毒力菌株和非毒力菌株的遺傳統(tǒng)計數(shù)據(jù)Tab. 4 Genetic statistics of virulent strains and non-virulent strains of Vibrio alginolyticus

利用UPGMA法對28株溶藻弧菌進行聚類分析(圖 4), 其中 4株毒力菌株(HN08811、HN08155、HN08809、HN08813)的親緣關(guān)系很近, 明顯聚為一類。圖 3中黑色箭頭所指的條帶是該類菌株的特異多態(tài)性條帶; 毒力菌株 HN08335與非毒力菌株HN08803聚為一類, 它們的遺傳相似度和遺傳距離分別為0.814 3和0.205 4; 毒力菌株HN07006與非毒力菌株 HN08304聚為一類, 它們的遺傳相似度和遺傳距離也分別為 0.814 3和 0.205 4。毒力菌株HN08335和HN07006與另外4株毒力菌株的遺傳相似度和遺傳距離詳見表5。

3 討論

Warmer等[13]認為包括溶藻弧菌在內(nèi)的多種弧菌具有很強的遺傳多樣性; Ripabelli[14]和 George[15]的實驗都證明相同生物來源的溶藻弧菌菌株具有明顯差異; 陳償?shù)萚8]發(fā)現(xiàn), 海南省三亞與陵水地區(qū)的高密度對蝦養(yǎng)殖場中, 溶藻弧菌的基因型也表現(xiàn)為較高的多樣性。本實驗結(jié)果表明, 溶藻弧菌變異性強, 6株毒力菌株之間的遺傳距離變幅為0.242 8, 22株毒力菌株之間的遺傳距離變幅為 0.630 6, 菌株遺傳多樣性豐富, 這與前人的研究結(jié)果基本一致; 而且, 毒力菌株的Nei’s基因多樣度和Shannon’s信息指數(shù)都明顯高于非毒力菌株, 這很可能是由于毒力菌株比非毒力菌株變異性更高所致。前人的研究表明, 溶藻弧菌的毒力基因主要存在于基因組中, 而與質(zhì)粒無關(guān)[16-17]。因此, 作者推測溶藻弧菌的毒力相關(guān)功能基因可能是導(dǎo)致毒力菌株與非毒力菌株之間產(chǎn)生明顯遺傳差異主要原因之一, 這些毒力相關(guān)功能基因應(yīng)該存于染色體基因組中, 而且, 溶藻弧菌毒力基因系統(tǒng)并非簡單的由一個或者幾個基因構(gòu)成, 更可能是由許多相關(guān)基因[18-20]組成, 這些基因直接影響整個基因組遺傳多樣性。

本實驗結(jié)果還表明, 在遺傳距離為 0.21處, 所有菌株可分為4個組, 其中第1組含有2株毒力菌株(HN08335和HN07006)和20株非毒力菌株; 第2組只含有1株細菌, 即TG06003, 表明來源于泰國的菌株與海南地區(qū)的菌株遺傳差異較大, 屬于不同的地理種群; 第3組也只含有1株細菌, 為HN08303, 這

圖4 溶藻弧菌的UPGMA親緣關(guān)系聚類圖Fig. 4 The UPGMA dendrogram of vibrio alginolyticus

表5 溶藻弧菌毒力菌株之間的遺傳多樣度和遺傳距離Tab. 5 Genetic diversity and genetic distances among virulent strains of Vibrio alginolyticus

一菌株也與其他菌株差異較大; 第 4組則只含有 4 株毒力菌株, 即 HN08811、HN08155、HN08809、HN08813, 表明這4株細菌與其他24株的遺傳差異較大, 為一個相對獨立的遺傳型。本實驗室采用抑制性差減雜交技術(shù), 以非毒力菌株 HN08801為驅(qū)動子(Driver), 構(gòu)建了毒力菌株HN08155差減基因組文庫,從中獲得了80個可能與毒力相關(guān)基因片段, 并以上述 80個毒力相關(guān)基因?qū)@ 28個菌株作了基因型分析, 結(jié)果也表明, HN08155、HN08809、HN08811、HN08813這4株毒力菌株的親緣關(guān)系更近(結(jié)果正在整理中)。因此, 盡管溶藻弧菌不同菌株之間的變異性可能很高, 但還是存在同一遺傳型毒力菌株的可能。同時, 本實驗確定了 HN08155、HN08809、HN08811、HN08813這 4株毒力菌株的特異性條帶(圖 3), 該條帶可以作為鑒定這類遺傳型毒力菌株的分子標記, 可用于因這類遺傳型溶藻弧菌引發(fā)的重大流行病的快速診斷。

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RAPD analysis of genetic diversity ofVibrio alginolyticusisolated from Hainan province

OU YANG Ji-long, ZHOU Yong-can, WU Xue-Gui, DAI Xiao-lian, WANG Shi-feng,XIE Zhen-yu
(Hainan University, Key Laboratory of Tropical Aquatic Biotechnology of Hainan Province, Haikou 570228, China)

Sep., 12, 2010

Vibrio alginolyticus; RAPD, virulent strains; genetic diversity

Taking the Thai strain TG06003 as a control, 27 strains ofVibrio alginolyticuscollected from Hainan maricultural environment were analyzed using the random amplified polymorphic DNA marker (RAPD) method.Six strains were virulent and the other 22 strains were non-virulent. Seventy polymorphic bands were produced by PCR with eight selected primers, and the PPB was 98.6%. The arithmetic average and the weighted average of gene diversity were 0.922 and 0.454 4, respectively, and the arithmetic average and the weighted average of Shannon’s information index were 0.1391 and 0.171 3, respectively. Distribution of genetic similarity was between 0.442 9 ～0.885 7, and genetic distances were distributed between the 0.121 4～0.752 0. Virulent strains HN08811, HN08155,HN08809, and HN08813 were clearly clustered together. However, the other two virulent strains were clustered with non-virulent strains. The gene diversity of virulent strains was high, and their genetic diversity and Shannon’s information index were significantly higher than those of non-virulent strains. Our results indicate that virulent strains and non-virulent strains ofVibrio alginolyticushave multiple genetic types.

S941.42

A

1000-3096(2011)07-0030-07

2010-09-12;

2011-03-21

國家科技支撐計劃項目(2009BAB44B02); 國家自然科學(xué)基金項目(30760190, 31060360); 霍英東教育基金會高等院校青年教師基金基礎(chǔ)性研究課題(121030); 農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化項目(2009GB2E200302)

歐陽吉隆(1986-), 男, 江西吉安人, 碩士研究生, 研究方向：水生生物病害與控制, 電話： 15248929458, ouyangjilong23@yahoo.com.cn;謝珍玉, 通信作者, 博士后, 副教授, xiezyscuta@163.com

梁德海)