畢可然, 張曉君, 梁利國, 閻斌倫

(淮海工學(xué)院 江蘇省海洋生物技術(shù)重點實驗室, 江蘇 連云港 222005)

矛尾復(fù)蝦虎魚潰瘍病病原創(chuàng)傷弧菌的鑒定

畢可然, 張曉君, 梁利國, 閻斌倫

(淮海工學(xué)院 江蘇省海洋生物技術(shù)重點實驗室, 江蘇 連云港 222005)

2009年8月江蘇連云港贛榆縣多家蝦蟹養(yǎng)殖塘混養(yǎng)的矛尾復(fù)蝦虎魚(Synechogobius hasta)大量死亡, 從病魚深層潰爛組織及肝臟中分離出大量優(yōu)勢生長的細菌, 人工感染試驗證明分離菌對蝦虎魚的半數(shù)致死量(LD50)為1.63×106cfu/g。對分離菌進行了形態(tài)特征、理化特性和分子生物學(xué)等方面的分析。一方面, 分離菌株16S rRNA和gyrB基因序列的BLAST搜索及最大簡約法分析均表明其與創(chuàng)傷弧菌(Vibrio vulnificus)親緣關(guān)系最近; 另一方面, 分離菌革蘭氏陰性, 氧化酶陽性, 葡萄糖發(fā)酵型。因此, 引起江蘇連云港贛榆縣矛尾復(fù)蝦虎魚潰瘍病病原菌是弧菌屬的創(chuàng)傷弧菌。

矛尾復(fù)蝦虎魚(Synechogobius hasta); 創(chuàng)傷弧菌(Vibrio vulnificus); 16S rRNA基因;gyrB基因

矛尾復(fù)蝦虎魚(Synechogobius hasta)隸屬鱸形目(Perciformes)蝦虎魚科(Gobiidae)。俗稱海鯰魚、沙光魚、扔巴魚, 是暖溫性近海中小型底層魚類,主要產(chǎn)于中國渤海、黃海、東海、臺灣海峽及沿海咸淡水水域[1], 是最近幾年在中國華北和華中大規(guī)模養(yǎng)殖的經(jīng)濟魚類[2]。該魚肉質(zhì)細微, 粗蛋白質(zhì)、脂類、能源、磷和氨基酸等表觀消化率高[3], 深受消費者青睞。但隨著養(yǎng)殖規(guī)模的逐年擴大、養(yǎng)殖密度的日益提高, 在2009年8～9月, 江蘇連云港贛榆縣多家蝦蟹養(yǎng)殖池塘內(nèi)的矛尾復(fù)蝦虎魚發(fā)生病害,造成了巨大的經(jīng)濟損失。因此, 病害已成為制約矛尾復(fù)蝦虎魚健康養(yǎng)殖發(fā)展的關(guān)鍵因素之一。為了明確矛尾復(fù)蝦虎魚暴發(fā)性死亡原因, 本研究自發(fā)病蝦虎魚潰爛肌肉組織、肝臟中分離到菌落特征一致的優(yōu)勢生長細菌, 采用細菌常規(guī)生化鑒定方法和分子生物學(xué)分析方法對發(fā)病矛尾復(fù)蝦虎魚進行了致病菌的鑒定, 旨在為科學(xué)防治矛尾復(fù)蝦虎魚疾病提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病魚檢驗及細菌分離

2009年 8月, 江蘇連云港贛榆縣蝦蟹養(yǎng)殖塘混養(yǎng)矛尾復(fù)蝦虎魚發(fā)生嚴重疾病, 其癥狀為頭部及體表出血, 部分病魚肌肉潰爛, 嚴重的露出骨骼; 剖檢可見病魚肝臟出血、腫脹, 腸壁發(fā)紅, 個別病魚肝臟糜爛。隨機取體表出血及潰爛嚴重的瀕死病魚10尾經(jīng) 75%酒精棉球擦拭消毒并刮去表層, 以該深層潰爛組織、肝胰臟為樣品, 劃線接種于普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基, 28℃培養(yǎng)24 h檢查, 取分離菌移接于普通營養(yǎng)瓊脂斜面(28℃培養(yǎng)24 h)做純培養(yǎng)供檢驗用, 菌株編號： S0908-2。

1.2 致病性試驗

從連云港市贛榆縣一家養(yǎng)殖池塘取規(guī)格一致、健康無病的矛尾復(fù)蝦虎魚 100尾。在實驗室水族箱系統(tǒng)內(nèi)暫養(yǎng)2周后試驗用。取平均初始體質(zhì)量28 g左右的矛尾復(fù)蝦虎魚 40尾, 隨機分為 5組, 每組 8尾, 置于5個室內(nèi)流水容積為80 L長方形玻璃纖維鋼水族箱中。供試菌株S0908-2接種于普通營養(yǎng)肉湯,28℃過夜培養(yǎng), 供試菌液調(diào)至 2.1×108、2.1×107、2.1×106、2.1×105cfu/mL, 共 4個稀釋度, 分別對 4組健康矛尾復(fù)蝦虎魚腹腔注射, 每尾 0.1 mL, 對照組接種同劑量無菌營養(yǎng)肉湯。接種后水族箱水溫(27±2)℃, 連續(xù)充氣, 每天換水, 定時觀察記錄 2周,計算半數(shù)致死量(LD50)。

1.3 形態(tài)觀察及理化特性分析

對供試菌株 S0908-2涂片經(jīng)革蘭氏染色后鏡檢其形態(tài)。取純培養(yǎng)菌, 分別接種于細菌理化特性鑒定用培養(yǎng)基中, 按常規(guī)進行氧化酶、接觸酶、糖(醇及苷)類代謝、H2S、吲哚、MR、V-P試驗、硝酸鹽還原、OF試驗和枸櫞酸鹽利用等較系統(tǒng)的理化特性測定, 主要參照文獻[4]及文獻[5]進行。培養(yǎng)基及細菌微量生化反應(yīng)管等購自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.4 16S rRNA和gyrB基因序列測定及系統(tǒng)發(fā)生分析

取純培養(yǎng)供試菌液接種于含鹽1%的LB肉湯中28℃培養(yǎng)16 h, 按小量細菌基因組DNA抽提試劑盒(上海賽百盛基因技術(shù)有限公司)所述方法提取基因組DNA保存于-20℃冰箱供PCR使用。提取的基因組分別利用細菌 16S rRNA 基因通用引物對 27F：5'-AGA GTT TGA TC(C/A) TGG CTC AG-3'; 1492R：5'-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3'[6]和gyrB基因PCR通用引物對UP1： 5'-GAA GTC ATC ATG ACC GTT CTG CAY GCN GGN GGN AAR TTY GA-3';UP2r： 5'-AGC AGG GTA CGG ATG TGC GAG CCR TCN ACR TCN GCR TCN GTCAT-3'[7]進行 PCR擴增。每對PCR反應(yīng)體系為 20 μL： 無菌蒸餾水14.4 μL,10×PCR 緩沖液 2 μL, 1.5 mmol/L MgCl21.6 μL,4×dNTP 混合物 0.4 μL, 10 pmol/L 引物各 0.2 μL,2.5U/μL 的 Taq DNA 聚合酶 0.2 μL, Genomic DNA 1μL。PCR反應(yīng)條件為： 95℃預(yù)變性5 min; 94℃變性1 min、55℃(27F/1492R)和 57℃(UP1/ UP2r)退火 1 min、72℃延伸2 min, 30個循環(huán); 最后72℃延伸8 min。PCR擴增產(chǎn)物送上海生物工程技術(shù)公司測序部測序。

測序后的序列均使用 DNASTAR軟件包(Madison, Wisconsin)中SeqMan II軟件進行校對和拼接。拼接后的序列分別上傳到NCBI的BLAST檢索系統(tǒng)(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast/)進行同源性分析, 同時 GenBank數(shù)據(jù)庫中同源物種序列被下載利用 Clustal X1.8[8]軟件進行多序列比對, 比對后序列利用 PAUP4.0軟件包[9]中最大簡約法(maximum parsimony, MP)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹。

1.5 菌種分類位置確定

根據(jù)細菌形態(tài)、培養(yǎng)及理化特性測定的結(jié)果, 主要依據(jù)文獻[10], 文獻[11]及有關(guān)資料, 并結(jié)合細菌16S rRNA和gyrB基因系統(tǒng)發(fā)生分析結(jié)果, 進行分離菌的種屬分類位置判定。

2 結(jié)果

2.1 分離菌的致病性

人工感染實驗結(jié)果表明, 菌株 S0908-2對矛尾復(fù)蝦虎魚有較強的毒力, 半數(shù)致死量(LD50)為1.63×106cfu/g。取感染死亡蝦虎魚肝臟組織做細菌分離、培養(yǎng)和檢驗實驗, 結(jié)果不僅分離到大量優(yōu)勢生長的菌株, 同時該分離菌的形態(tài)、生長特性同菌株S0908-2相似。表明分離菌S0908-2是導(dǎo)致2009年8月連云港贛榆縣養(yǎng)殖矛尾復(fù)蝦虎魚潰瘍并大量死亡的病原菌。

2.2 菌體形態(tài)及理化特征

供試菌株 S0908-2革蘭氏染色為陰性短桿菌,大小在(0.5～0.8) μm×(0.8～3.2) μm; 在普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上, 菌落邊緣出現(xiàn)鋸齒狀, 單個菌落光滑圓形, 隆起, 半透明, 乳白色, 培養(yǎng)24 h檢查直徑多在 l mm左右。常規(guī)生理生化試驗表明, 菌株S0908-2氧化酶和接觸酶陽性, 葡萄糖發(fā)酵型, 符合弧菌屬共有特征; 該菌精氨酸雙水解酶陰性, 利用葡萄糖產(chǎn)酸, 不利用肌醇、蔗糖、阿拉伯糖, 在無NaC1胨水中不生長, 1%、3%和6%NaC1胨水中能生長, 這些指標與創(chuàng)傷弧菌(Vibrio vulnificus)的生理生化特性均一致, 因此可將其初步鑒定為創(chuàng)傷弧菌,其生理生化特性見表1。

2.3 16S rRNA 和gyrB基因序列與系統(tǒng)發(fā)育學(xué)

S0908-2菌株16S rRNA和gyrB基因序列全長依次是1450bp和1194bp。上傳NCBI經(jīng)BLAST同源性檢索結(jié)果均顯示與創(chuàng)傷弧菌16S rRNA、gyrB基因序列同源性最高, 均達到 99%?；诒葘Y(jié)果從GenBank數(shù)據(jù)庫分別下載已有弧菌屬菌株16S rRNA和gyrB基因同源序列, 下載的序列經(jīng) Clustal X1.8軟件比對分析后, 可構(gòu)建最大簡約樹的堿基分別是1311bp (16S rRNA )和1050bp (gyrB)。兩基因系統(tǒng)發(fā)生分析結(jié)果均支持分離菌株 S0908-2是創(chuàng)傷弧菌的一員, 系統(tǒng)發(fā)生樹見圖1和圖2。

3 討論

在細菌鑒定和系統(tǒng)分類學(xué)研究中, 核糖體小亞基rRNA(16S rRNA)基因素有“分子化石”之稱, 幾乎可以對所有的細菌進行屬水平上的鑒定[12]。然而,由于 16S rRNA 分子高度保守, 對序列相似性極高的近緣種無法做進一步區(qū)分, 常不能反映關(guān)系較近的物種間關(guān)系; 另16S rRNA基因序列的高級結(jié)構(gòu)對一級結(jié)構(gòu)進化有束縛, 序列比對時可能還必須考慮二級結(jié)構(gòu), 否則會影響系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的準確性[13]。因此, 在最近研究中, 一些研究者嘗試用其他保守的蛋白編碼基因進行細菌系統(tǒng)發(fā)育分析, 與16S rRNA基因序列分析得到的結(jié)果相互補充和驗證。gyrB基因是單拷貝的持家基因, 普遍存在于各種細菌中,編碼DNA 促旋酶(DNA gyrase)的B亞單位, 序列長度約1.2～1.4 kb, 平均堿基替換率為每100萬年變化0.7%～0.8%, 比16S rDNA 的每5000萬年變化1%的速率要快[14], 而且不發(fā)生水平轉(zhuǎn)移, 因此特別適用于菌種間的區(qū)別和鑒定。在弧菌科致病菌區(qū)分中, 基于gyrB基因序列分析, 16S rRNA基因不能區(qū)分的副溶血弧菌(V. parahaemolyticus)和溶藻弧菌(V.alginolyticus)、霍亂弧菌(V. cholera)等被明顯分為不同的致病菌[15], 在牡蠣創(chuàng)傷弧菌鑒定中, Kumar等[16]使用創(chuàng)傷弧菌gyrB基因特異引物gyr-vv1 和gyr-vv2實現(xiàn)了30 CFU/g創(chuàng)傷弧菌的低濃度檢測。本研究采用了細菌16S rRNA和gyrB基因通用引物對創(chuàng)傷弧菌疑似株序列進行了PCR擴增、測序和系統(tǒng)發(fā)生分析, 兩基因分析結(jié)果均支持S0908-2菌株隸屬于創(chuàng)傷弧菌, 同時在gyrB基因系統(tǒng)發(fā)生樹中, S0908-2菌株與已報道創(chuàng)傷弧菌菌株聚類節(jié)點的自引導(dǎo)值是99%(圖2), 而16S rRNA基因聚類節(jié)點自引導(dǎo)值僅為69%(圖1)。此外, 生理生化特性(在無鹽條件下不生長; 氧化酶、接觸酶陽性, 葡萄糖發(fā)酵型; 能利用D-半乳糖、乳糖、纖維二糖; 不利用蔗糖、阿拉伯糖; 精氨酸雙水解酶陰性等)也判定分離于發(fā)病矛尾復(fù)蝦虎魚的致病菌株為創(chuàng)傷弧菌。因此, 結(jié)合菌株生理生化特性和多基因分子鑒定, 確診連云港贛榆縣多家蝦蟹養(yǎng)殖塘混養(yǎng)的矛尾復(fù)蝦虎魚暴發(fā)的疫病為創(chuàng)傷弧菌病。

表1 菌株S0908-2與創(chuàng)傷弧菌的表型特征比較Tab. 1 Physiological and biochemical characteristics of S0908-2 and V. vulnificus

圖1 基于S0908-2分離菌株16S rDNA序列構(gòu)建的最大簡約樹Fig. 1 Maximum parsimony tree based on 16SrDNA sequence of the isolated S0908-2 strain

圖2 基于S0908-2分離菌株gyrB基因序列構(gòu)建的最大簡約樹Fig. 2 Maximum parsimony tree based on gyrB gene sequence of the isolated S0908-2 strain

創(chuàng)傷弧菌是一種有莢膜的革蘭氏陰性嗜鹽弧菌,廣泛分布于河口和沿海水域水產(chǎn)品中, 不僅是海水養(yǎng)殖經(jīng)濟動物弧菌病的主要致病菌之一, 可引起日本鰻鱺(Anguilla japonica)[17]、歐洲鰻鱺(Anguilla anguilla)[18]、羅非魚(Tilapia)[19]、石斑魚(Epinephelus)[20]、石鰈(Kareius bicoloratus)[21]、軍曹魚(Rachycentron canadum)[22]、大菱鲆(Scophthalmus maximus)[23]、黃姑魚(Nibea albiflora)[24]等暴發(fā)流行性病而大規(guī)模死亡; 同時還是引起人獸共患病的重要病原菌[25], 既能通過生食含菌的海產(chǎn)品引起原發(fā)性敗血癥和壞死性胃腸炎、腦膜炎、肺炎、角膜炎等疾病, 也能通過海水介質(zhì)致使皮膚創(chuàng)口組織壞死引起嚴重的創(chuàng)口感染。本研究中S0908-2菌株對矛尾復(fù)蝦虎魚表現(xiàn)出較強的致病性, 人工感染后較短時間內(nèi)發(fā)生死亡, 死亡個體頭部及體表出血, 肌肉潰爛, 腸壁發(fā)紅, 肝臟出血糜爛。對養(yǎng)殖和食用帶來很大危害。因此, 矛尾復(fù)蝦虎魚創(chuàng)傷弧菌病的研究將成為海水養(yǎng)殖業(yè)的重要課題之一。

綜上所述, 作者初步判定江蘇省連云港市特產(chǎn)經(jīng)濟動物-矛尾復(fù)蝦虎魚潰瘍病病原是弧菌屬的創(chuàng)傷弧菌。但有關(guān)此創(chuàng)傷弧菌對矛尾復(fù)蝦虎魚的致病機理, 在中國所有野生和養(yǎng)殖矛尾復(fù)蝦虎魚中的分布有待進一步研究。

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Identification ofVibrio vulnificusfromSynechogobius hastawith canker disease

BI Ke-ran, ZHANG Xiao-jun, LIANG Li-guo, YAN Bin-lun
(Key Laboratory of Oceanic Biotechnology of Jiangsu, Huaihai Institute of Technology, Lian Yungang 222005,China)

Nov., 2, 2010

Synechogobius hasta; Vibrio vulnificus;16S rRNA gene;gyrBgene

In August 2009, mass mortality ofSynechogobius hastawas observed in the shrimp and crabs pond of Ganyu county, Lianyungang city, Jiangsu province. Some pathogenic organisms were isolated from the liver and deep ulceration of the diseasedS. hasta. The dominant bacterial strain was Gram-negative, oxidase positive, and fermented glucose to produce acids. In addition, 16S rRNA andgyrBgenes analysis showed that isolation was closely related toVibrio vulnificusthan other bacterium. The sequences similarity coefficients were 0.99, on the other hand, and the phylogenetic trees strongly supported isolation were grouped with some reportedV. vulnificus.Moreover, the LD50of the bacteria toS. hastawas 1.63×106cfu/g. We concluded thatV.vulnificuswas an important pathogenic bacteria causing canker disease inS. hastain Ganyu county, Lianyungang city, Jiangsu province.

S968

A

1000-3096(2011)07-0020-06

2010-11-02;

2011-04-18

江蘇省水產(chǎn)三項工程資助項目(PJ2010-58); 江蘇省自然科學(xué)基金資助項目(BK2009163); 江蘇省生物多樣性與生物技術(shù)重點實驗室開放基金資助項目(164070302104)

畢可然(1978-), 女, 內(nèi)蒙古人, 講師, 博士, 主要從事水產(chǎn)動物病原鑒定和檢測研究, 電話： 15896101504, E-mail：bikeran@126.com; 張曉君, 通信作者, 教授, E-mail：zxj9307@163.com

譚雪靜)