朱友芳, 林鳳欽, 王藝?yán)? 謝芳靖

(1. 福建省莆田市水產(chǎn)科學(xué)研究所, 福建 莆田 351100; 2. 集美大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院 福建省高校水產(chǎn)科學(xué)技術(shù)與食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 福建 廈門 361021)

3個(gè)花鰻鱺地理種群的AFLP分析

朱友芳1, 林鳳欽2, 王藝?yán)?, 謝芳靖2

(1. 福建省莆田市水產(chǎn)科學(xué)研究所, 福建 莆田 351100; 2. 集美大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院 福建省高校水產(chǎn)科學(xué)技術(shù)與食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 福建 廈門 361021)

應(yīng)用AFLP分子標(biāo)記技術(shù)首次對(duì)澳大利亞、海南島和菲律賓3個(gè)種群的共60尾花鰻鱺(Anguilla marmorata)幼魚樣品進(jìn)行了遺傳多樣性分析。4對(duì)選擇性擴(kuò)增引物共擴(kuò)增得到180個(gè)位點(diǎn), 平均每對(duì)引物擴(kuò)增出45個(gè)位點(diǎn)。澳大利亞、海南島和菲律賓3個(gè)種群的多態(tài)位點(diǎn)分別為78.33%、79.44%和84.44%,Nei′s遺傳多樣性指數(shù)分別為 0.330 2±0.188 9、0.337 2±0.194 6 和 0.357 1±0.176 7, Shannon′s多樣性指數(shù)分別為0.477 3±0.264 7、0.484 4±0.270 2和0.514 6±0.243 3; 根據(jù)基因分化系數(shù)和AMOVA分析估算,3個(gè)花鰻鱺種群遺傳變異分別有89.25%和96.07%存在于種群內(nèi), 10.75%和3.93%存在于種群間?；蚍只禂?shù)、AMOVA分析、遺傳距離、基因流、系統(tǒng)樹和顯性基因型頻率分析結(jié)果表明： 3個(gè)花鰻鱺種群間出現(xiàn)了遺傳分化, 地理距離越大遺傳分化程度越高, 三者之間出現(xiàn)一定的基因交流。研究結(jié)果對(duì)花鰻鱺養(yǎng)殖具有指導(dǎo)意義。

花鰻鱺(Anguilla marmorata); 種群; AFLP; 遺傳變異

花鰻鱺(Anguilla marmorata)隸屬鰻鱺目(Anguilliforme)、鰻鱺科(Anguillidae)、鰻鱺屬(Anguilla), 屬熱帶和亞熱帶江海洄游魚類, 分布范圍廣, 東達(dá)太平洋中部諸島, 西達(dá)非洲東部, 南達(dá)澳大利亞南部, 北達(dá)朝鮮、日本南部, 中國(guó)產(chǎn)于長(zhǎng)江以南至海南島各江河水域[1-2]。

有關(guān)不同種群花鰻鱺的骨骼結(jié)構(gòu)差異及遺傳多樣性已有研究報(bào)道, Watanabe等[3]通過對(duì)花鰻鱺脊椎骨的數(shù)目研究, 得出了密克羅西尼亞島(Micronesia)的花鰻鱺脊椎骨的數(shù)目與印度洋及太平洋其他12個(gè)花鰻鱺種群存在明顯差異的結(jié)論; Minegishi等[4]采用線粒體DNA和微衛(wèi)星分析的方法, 得出了可以將花鰻鱺劃分為南太平洋、北太平洋、東印度洋和西印度洋4個(gè)種群的結(jié)論; Gong等[5]采用微衛(wèi)星分析的方法, 得出了花鰻鱺的 Aus(澳大利亞)種群和中國(guó)種群的多樣性指數(shù)相似、所有位點(diǎn)均符合哈迪-溫伯格平衡的結(jié)論; 齊興柱等[6]通過對(duì)線粒體細(xì)胞色素b基因的測(cè)序, 得出了花鰻鱺的日本和夏威夷種群的地理差異小于Hai(中國(guó)海南島)種群與它們之間的地理差異的結(jié)論。

擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(Amplified Fragment Length Polymorphism,簡(jiǎn)稱 AFLP)具有多態(tài)性強(qiáng), 譜帶豐富且清晰可辨, 實(shí)驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定性、重復(fù)性好的特點(diǎn), 可以在一次實(shí)驗(yàn)中同時(shí)觀察到大量的限制性片段。因此, AFLP技術(shù)廣泛應(yīng)用于種質(zhì)鑒定、基因克隆和定位、遺傳圖譜構(gòu)建和遺傳差異分析等研究[7-12]。目前中國(guó)花鰻鱺養(yǎng)殖的苗種主要來源于澳大利亞、海南島和菲律賓三地,三者在水溫、馴食和抗病力等方面均存在差異。為了分析產(chǎn)生這些差異的原因, 本研究首次采用 AFLP技術(shù)對(duì)花鰻鱺的 Aus種群、Hai種群和 Phi(菲律賓)種群進(jìn)行遺傳多樣性分析, 研究結(jié)果對(duì)花鰻鱺養(yǎng)殖具有一定的指導(dǎo)意義。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)魚

收集 Aus墨爾本附近海域、Hai東海岸和 Phi棉蘭老島東部的花鰻鱺幼魚各 20尾, 取肌肉固定于95%的酒精中, 4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 基因組DNA提取

DNA提取和純化參照 Sambrook等[13], 采用苯酚/氯仿法提取總DNA。DU640紫外分光光度儀測(cè)定DNA濃度, 用無菌雙蒸水將模板的一部分稀釋到20 mg/L, 置于4℃中保存, 其余的未稀釋的模板母液放于-20℃冰箱中備用, 通過 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的完整性以及純度, 凝膠電泳采用GDST500紫外凝膠成像分析系統(tǒng)。

1.3 AFLP指紋圖譜構(gòu)建

參照 Vos等[14]和 Wang等[15]方法構(gòu)建 AFLP指紋圖譜。AFLP接頭和預(yù)擴(kuò)增引物序列見表1。2種內(nèi)切酶分別為EcoR I和Mse I。經(jīng)過預(yù)實(shí)驗(yàn)從8種EcoR I引物(E-AA、E-AC、E-AG、E-AT、E-TA、E-TC、E-TG和 E-TT)和 8種 Mse I引物(M-CAA、M-CAC、M-CAG、M-CAT、M-CTA、M-CTC、M-CTG和 M-CTT)共 64對(duì)引物組合中, 篩選出 4對(duì)選擇性擴(kuò)增引物組合(4對(duì)引物組合分別為： E- TG/M-CAC,E-TG/M-CAT, E-AA/M-CAC, E-AA/M-CAA)進(jìn)行AFLP分析。AFLP試劑盒購(gòu)自invitrogen公司。

表1 AFLP接頭及預(yù)擴(kuò)增引物序列Tab. 1 Adaptors and pre-amplification primer sequences in AFLP analysis

1.3.1 酶切反應(yīng)

每個(gè)樣品的酶切混合液包括： 160 ng的 DNA樣品, 0.2 μL的Mse I(Mse I 10 mol/L), 4 μL的10×Tango反應(yīng)緩沖液, 再加雙蒸水至反應(yīng)總體積18 μL。將反應(yīng)混合液置于 MJ-PTC200溫度梯度 PCR儀中進(jìn)行Mse I酶切, Mse I酶切反應(yīng)條件： 65℃ 3 h, 80℃ 15 min, 4℃ 5 min。反應(yīng)結(jié)束后, 再加入0.2 μL的 EcoR I(EcoR I 10 mol/L), 加雙蒸水至總反應(yīng)體積20 μL,進(jìn)行EcoR I酶切, EcoR I酶切反應(yīng)條件： 37℃ 3 h,80℃ 15 min, 4℃ 5 min。1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)酶切效果, 4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 連接反應(yīng)

每個(gè)連接反應(yīng)混合液包括： 酶切樣品10 μL, 10 nmol/L EcoR I/Mse I接頭 0.8 μL, 10×T4反應(yīng)緩沖液2 μL, 1 mol/L T4連接酶 0.5 μL, 加雙蒸水至總體積20 μL, 22℃恒溫過夜。-20℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)

反應(yīng)混合液包括： 2 μL 的連接產(chǎn)物, 2 μL的10×Taq buffer, 1.6 μL 的 25 nmol/L MgCl2, 0.5 μL 的dNTPs(10 mmol/L), 0.17 μL 的 E0(33 mol/L), 0.17 μL的M0(33 mol/L), 13.46 μL的無菌雙蒸水, 0.1 μL的Taq DNA 聚合酶(5 U /μL), 共 20 μL。PCR 反應(yīng)條件：先 94℃ 1 min; 再 94℃ 30 s, 56℃ 60 s, 72℃ 60 s,共20個(gè)循環(huán); 4℃ 5 min。預(yù)擴(kuò)增完成后, 將產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠中檢測(cè)預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物的效果。將預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物取出5 μL加入45 μL雙蒸水, 混合均勻作為選擇性擴(kuò)增模板。

1.3.4 選擇性擴(kuò)增反應(yīng)

取5.0 μL的選擇性擴(kuò)增模板, 各加入15.0 μL選擇性擴(kuò)增反應(yīng)混合液： 2.0 μL的10×Taq buffer, 1.2 μL的 25 nmol/L MgCl2, 0.4 μL 的 dNTPs(10 mmol/L),10.2 μL的無菌雙蒸水, 0.5 μL的 EcoR I引物(10μmoL/L), 0.5 μL 的 Mse I引物(10 μmoL/L)。0.2 μL的Taq DNA聚合酶(5 U /μL)。PCR反應(yīng)條件： 首先94℃ 1 min; 再 94℃ 30 s, 65℃ 30 s, 72℃ 60 s, 循環(huán) 13次(每一循環(huán)退火溫度減少 0.7℃), 然后 94℃30 s, 65℃ 30 s, 72℃ 60 s, 23 個(gè)循環(huán); 72℃ 10 min;4℃ 5 min。最后4℃保存。

1.3.5 變性聚丙烯酰胺凝膠電泳

AFLP擴(kuò)增產(chǎn)物(共 20 μL)在電泳前加入 10 μL上樣緩沖液, 95℃變性5 min, 立即放入冰盒中冷卻(防止復(fù)性)。采用 6%的變性聚丙烯酰胺凝膠, 電泳緩沖液為 1×TBE, 在恒電壓 2 000 V 下使用美國(guó)Bio-Rad聚丙烯酰胺凝膠電泳儀電泳, 先預(yù)電泳30～45 min, 直至溫度達(dá)到 55℃。然后每個(gè)樣品取5 μL上樣, 恒電壓2000V電泳2 h左右, 用銀染法顯示電泳結(jié)果。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

對(duì)所有擴(kuò)增清晰的條帶進(jìn)行記錄, 采用“0-1”系統(tǒng)記錄譜帶位置, 觀察擴(kuò)增條帶的有無, 有帶記為“1”, 無帶記為“0”。將上述獲得的 AFLP指紋圖譜轉(zhuǎn)換成 1和 0構(gòu)成的數(shù)字矩陣, 結(jié)果填入Microsoft Excel 表格中。在種群處于Hardy-Weinberg平衡的條件下, 利用POPGENE VERSION 1.31[16]軟件統(tǒng)計(jì)位點(diǎn)總數(shù)、多態(tài)位點(diǎn)數(shù), 計(jì)算多態(tài)位點(diǎn)頻率、顯性基因型頻率、Nei′s基因多樣性指數(shù)、Shannon′s多樣性指數(shù)、種群總基因多樣性、種群內(nèi)基因多樣性、種群間的Gst(基因分化系數(shù))、種群間的Nm(基因流系數(shù))、遺傳相似度和遺傳距離等。利用 Arlequin 3.5進(jìn)行 AMOVA分析, 采用 MEGA 3軟件以UPGMA法對(duì)3個(gè)種群進(jìn)行聚類分析, 構(gòu)建群體間親緣演化系統(tǒng)樹圖譜。

2 結(jié)果

2.1 3個(gè)種群AFLP擴(kuò)增結(jié)果及遺傳多樣性

用 4對(duì)選擇性引物(即引物組合 E-TG/M-CAC,E-TG/M-CAT, E-AA/M-CAC, E-AA/M-CAA)對(duì)花鰻鱺3個(gè)種群共60個(gè)樣本的DNA進(jìn)行AFLP分析, 共擴(kuò)增出180條清晰的條帶, 其中多態(tài)性條帶為160條,Aus、Hai和Phi 3個(gè)種群的多態(tài)位點(diǎn)分別為78.33%、79.44%和84.44%, 總多態(tài)位點(diǎn)比率為88.89%(表2)。將每個(gè)擴(kuò)增片段視為一個(gè)基因位點(diǎn), 每對(duì)引物檢出的位點(diǎn)數(shù)從34～50個(gè)不等, 平均每對(duì)引物檢出45個(gè)位點(diǎn)。在3個(gè)種群中, Phi種群的遺傳多樣性最高, 而Aus種群的遺傳多樣性最低。

表2 3個(gè)種群擴(kuò)增結(jié)果及遺傳學(xué)參數(shù)Tab. 2 Amplification results and parameters of genetic diversity in the three Anguilla marmorata populations

2.2 3個(gè)種群的遺傳分化及聚類分析

根據(jù)Gst(表3)和AMOVA分析估算(表4), 3個(gè)花鰻鱺種群遺傳變異分別有89.25%和96.07%存在于種群內(nèi), 10.75%和3.93%存在于種群間。

根據(jù) Wright[17]的標(biāo)準(zhǔn),Gst值介于 0～0.05, 表明種群間遺傳分化較弱; 介于 0.05～0.15, 表明種群間遺傳分化中等; 0.15～0.25表明種群間遺傳分化較大;當(dāng)Gst值＞0.25表明分化極大。由表3得出Aus種群～Hai種群、Aus種群～Phi種群和 Hai種群～Phi種群均出現(xiàn)中等遺傳分化。

地理距離： Aus～Hai＞Aus～Phi＞Hai～Phi;Gst(表3)： Aus種群～Hai種群＞Aus種群～Phi種群＞Hai種群～Phi種群; 遺傳距離(表 5)： Aus 種群～Hai種群＞Aus種群～Phi種群＞Hai種群～Phi種群, 可見地理距離越大遺傳分化程度越高。

通常認(rèn)為種群間的Nm＜1, 種群間基因交流是有限的, 若Nm＞1, 說明種群間通過某種渠道進(jìn)行基因交流[18]?；狑~兩兩種群間的Nm和 3個(gè)種群的總Nm均超過1, 說明種群間有基因交流。3個(gè)花鰻鱺種群間的Nm以Hai種群～Phi種群最高。

將 180個(gè)擴(kuò)增位點(diǎn)的顯性基因型頻率以 10%為單位劃分區(qū)間, 0和1分別設(shè)為一個(gè)單獨(dú)的區(qū)間, 統(tǒng)計(jì)顯性基因型頻率位于各區(qū)間內(nèi)的位點(diǎn)數(shù)。通過對(duì)不同種群的顯性基因型頻率在各區(qū)間內(nèi)的位點(diǎn)數(shù)的走勢(shì)比較, 可以分析出各種群遺傳結(jié)構(gòu)是否存在差異。由圖1可以看出3個(gè)種群的曲線走勢(shì)呈現(xiàn)出規(guī)律性, 總體趨勢(shì)基本相似, 但有差異： Aus種群與Phi種群在0～9%和40%～69%區(qū)間走勢(shì)不同; Aus種群與Hai種群在 0～9%和 50%～69%區(qū)間走勢(shì)不同; Hai種群和Phi種群在40%～59%區(qū)間走勢(shì)不同。說明3個(gè)種群在遺傳結(jié)構(gòu)方面存在一定的差異。通過計(jì)算花鰻鱺3個(gè)不同地理種群之間的Nei′s遺傳相似度和遺傳距離(表5), 根據(jù)遺傳距離構(gòu)建系統(tǒng)樹(圖2), 由圖2中看出Hai種群和Phi種群親緣關(guān)系較近, 首先聚在一起, 它們與Aus種群親緣關(guān)系較遠(yuǎn), 最后聚在一起。

表3 3個(gè)花鰻鱺種群遺傳分化Tab. 3 Genetic differentiation for the three populations of Anguilla marmorata

表4 花鰻鱺種群的AMOVA分析數(shù)據(jù)Tab. 4 Data derived from AMOVA of Anguilla marmorata

表5 種群間遺傳相似度(對(duì)角線*上)及遺傳距離(對(duì)角線*下)Tab. 5 Inter-population genetic identity (above diagonal)and genetic distance (below diagonal)

圖1 擴(kuò)增位點(diǎn)數(shù)在不同顯性基因頻率區(qū)間內(nèi)分布Fig. 1 Distributions of amplified loci in different frequency intervals

圖2 UPGMA方法構(gòu)建3個(gè)花鰻鱺種群的系統(tǒng)樹Fig. 2 UPGMA dendrogram by AFLP in the three Anguilla marmorata populations

3 討論

Aus種群和Hai種群的Nei’s遺傳多樣性指數(shù)分別為 0.330 2±0.188 9 和 0.337 2±0.194 6、Shannon′s多樣性指數(shù)分別為0.477 3±0.264 7和0.484 4±0.270 2,Aus和Hai兩種群多樣性指數(shù)相似, 這與采用微衛(wèi)星分析的方法得出的花鰻鱺 Aus種群和中國(guó)種群多樣性指數(shù)相似的結(jié)論一致[5]。

有關(guān)研究人員采用 AFLP技術(shù)對(duì)日本鰻鱺(Anguilla japonica)[9]、藍(lán)圓鲹(Decapterus maruadsi)[10]和魚(Miichthys miiuy)[11]進(jìn)行遺傳多樣性分析, 得出了這三種魚的多態(tài)位點(diǎn)比例分別為62.81%～74.10%、64.65%和68.86%～72.51%, 并根據(jù)多態(tài)位點(diǎn)比例認(rèn)為日本鰻鱺、藍(lán)圓鲹和魚遺傳多樣性較高。3個(gè)花鰻鱺種群多態(tài)位點(diǎn)比例為 78.33%～84.44%, 高于日本鰻鱺、藍(lán)圓鲹和魚, 可見3個(gè)花鰻鱺種群遺傳多樣性目前還處在較高的水平。我們認(rèn)為與花鰻鱺自然產(chǎn)卵、產(chǎn)卵后親魚死亡、自然種群分布廣、人為干擾因素較少等相關(guān)。

Minegishi等[4]采用線粒體DNA和微衛(wèi)星分析的方法, 將花鰻鱺劃分為南太平洋、北太平洋、東印度洋和西印度洋4個(gè)種群, 據(jù)此分析, 屬于南太平洋的Aus種群與屬于北太平洋的Hai種群和Phi種群出現(xiàn)了遺傳分化, 這與本次研究所得的結(jié)論一致。齊興柱等[6]在利用細(xì)胞色素 b基因?qū)Σ煌赜蚧狑~種群進(jìn)行分析時(shí)得出了同位于北太平洋花鰻鱺的日本種群和 Hai種群兩者之間存在地理差異, 本次研究同樣也得出了同位于北太平洋Hai種群和Phi種群間出現(xiàn)了遺傳分化的結(jié)論。

研究結(jié)果表明, 3個(gè)花鰻鱺種群間出現(xiàn)了中等程度的遺傳分化, 我們認(rèn)為原因可能為： 花鰻鱺于成年時(shí)降河洄游到江河口附近性腺才開始發(fā)育, 而后入深海進(jìn)行繁殖。初孵出仔魚為白色薄軟的葉狀體,葉狀體尚不能自主游動(dòng), 依靠海流將其帶到陸地沿岸后發(fā)生變態(tài), 變成短的圓線條狀的幼鰻, 進(jìn)入淡水河湖內(nèi)索食生長(zhǎng)。由于 3個(gè)花鰻鱺種群性腺成熟的時(shí)間及到達(dá)產(chǎn)卵場(chǎng)的時(shí)間不同, 不同種群親魚所產(chǎn)的仔魚在不同的海流的作用下, 于特定的時(shí)間到達(dá)特定的地域, 因此3個(gè)種群難以融合在一起形成1個(gè)隨機(jī)交配的大種群, 3個(gè)種群間出現(xiàn)中等程度的遺傳分化。

花鰻鱺兩兩種群間的Nm和3個(gè)種群的總Nm均超過 1, 種群間有基因交流, 遺傳分化與地理距離成正相關(guān), 原因可能是： 雖然不同種群花鰻鱺的親魚因產(chǎn)卵時(shí)間的差異而無法交配, 但花鰻鱺魚卵和仔魚隨海流漂浮和遷移, 不同年份海流的變化可能使少數(shù)花鰻鱺的魚卵和仔魚的漂浮和遷移路線發(fā)生變化, 混合到其他種群中, 種群內(nèi)魚卵和仔魚的遷入遷出減弱了種群間的遺傳分化, 產(chǎn)生了一定的基因交流, 地理距離越遠(yuǎn), 攜帶不同種群花鰻鱺魚卵和仔魚的海流混合的機(jī)會(huì)越少, 因此遺傳分化與地理距離成正相關(guān)。

中國(guó)花鰻鱺養(yǎng)殖苗種主要來源于Aus、Hai和Phi三地, 三者在水溫、馴食和抗病力方面均表現(xiàn)出差異,如與Hai和Phi的苗種相比, Aus的苗種可適應(yīng)較低的水溫, 在精養(yǎng)池中比較容易馴食, 但容易發(fā)生單鰓病等病害, 而 Hai的苗種則為三者中最難馴食的,由水絲蚓(Limnodrilus hoffmeisteri)轉(zhuǎn)為配合飼料往往無法轉(zhuǎn)換成功, 究其原因可能與 3個(gè)種群間的遺傳分化有關(guān)。因此, 在今后的養(yǎng)殖生產(chǎn)中必須加強(qiáng)花鰻鱺的基礎(chǔ)生物學(xué)研究, 對(duì)不同產(chǎn)地的花鰻鱺采用不同的養(yǎng)殖模式、馴食方式和誘食劑等, 以滿足各自生長(zhǎng)的需要, 達(dá)到高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的目的。

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AFLP analysis of threeAnguilla marmoratageographic populations

ZHU You-fang1, LIN Feng-qin2, WANG Yi-lei2, XIE Fang-jing2
(1. Putian Municipal Institute of Fishery Science, Putian 351100, China; 2. The Key Laboratory of Science and Technology for Aquaculture and Food Safety, Fisheries College, Jimei University, Xiamen 361021, China)

Dec., 08, 2010

Anguilla marmorata; population; AFLP; genetic variation

This study is the first of its kind to document genetic diversity of giant mottled eel (Anguilla marmorata) among three geographic populations of Australia, Hainan Island, and Philippines. This study was performed on 60 young eels by using AFLP molecular marker technique. A total of 180 AFLP loci, of which 160 loci were polymorphic, were detected by four primer combinations. The percentage of polymorphic loci from Australia, Hainan Island, and Philippines was 78.33%, 79.44%, and 84.44%, respectively; Shannon's diversity index was 0.477 3±0.264 7, 0.484 4±0.270 2, and 0.514 6±0.243 3, respectively. TheGstand AMOVA analysis showed that there were 89.25% and 96.07% genetic variation within the three populations, and 10.75% and 3.93% genetic variation among populations. Our results indicate that genetic differentiation has occurred and has a positive correlation with geographic distant. Meanwhile, gene flows exist among all three populations. These data will be important for the farming management ofA. marmorata.

Q347

A

1000-3096(2011)08-0083-06

2010-12-08;

2011-06-13

福建省高校水產(chǎn)科學(xué)技術(shù)與食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室基金資助項(xiàng)目(2008J201)

朱友芳(1964-), 男, 福建仙游人, 副研究員, 碩士研究生,主要從事水產(chǎn)養(yǎng)殖及病害防治的研究, 電話： 0594-6298821, E-mail：e365cn@163.com

譚雪靜)