王寶珍, 張子平, 王藝?yán)? 王國棟, 鄒志華, 王淑紅, 賈錫偉

(1. 集美大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院 水產(chǎn)科學(xué)技術(shù)與食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 福建 廈門 361021; 2. 美國德克薩斯州立大學(xué) 化學(xué)與生化系, 德克薩斯 圣馬克斯 78666)

雜色鮑β-1, 3-葡聚糖識別蛋白基因的克隆和表達(dá)

王寶珍1, 張子平2, 王藝?yán)?, 王國棟1, 鄒志華1, 王淑紅1, 賈錫偉1

(1. 集美大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院 水產(chǎn)科學(xué)技術(shù)與食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 福建 廈門 361021; 2. 美國德克薩斯州立大學(xué) 化學(xué)與生化系, 德克薩斯 圣馬克斯 78666)

從雜色鮑(Haliotis disversicolor)的表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)中首先鑒定出β-1, 3-葡聚糖識別蛋白基因片段(beta-1,3-glucan recognition protein,saβgrp)。通過 5′RACE 獲得 5′端序列, 并用由頭至趾(head to toe)PCR方法檢測全長cDNA序列的正確性。saβgrp的cDNA全長為1 459 bp, 包括387 bp的5′非編碼區(qū), 987 bp的開放閱讀框, 85 bp的3′非編碼區(qū)。saβgrp開放閱讀框編碼328個氨基酸。與現(xiàn)有報(bào)道的β-1,3-葡聚糖識別蛋白均含信號肽不同, 本研究所獲得的雜色鮑saβGRP不含信號肽, 為非分泌型蛋白。實(shí)時定量PCR分析表明： 經(jīng)副溶血弧菌誘導(dǎo)后, 24 h的實(shí)驗(yàn)組saβgrp的表達(dá)水平極顯著高于對照組(P＜0.01), 48 h的實(shí)驗(yàn)組saβgrp基因顯著高于對照組(P＜0.05)。

saβgrp; 副溶血弧菌; 雜色鮑(Haliotis disversicolor)

無脊椎動物因缺乏抗體和獲得性免疫, 所以主要通過先天性免疫來發(fā)揮免疫防御作用。先天性免疫反應(yīng)作為機(jī)體防御感染的第一道防線, 其發(fā)揮防御作用的關(guān)鍵主要是對病原相關(guān)分子模式(pathogenassociated molecular patterns, 簡稱 PAMPs)的識別,這一識別主要是由模式識別受體(pattern-recognition receptors, 簡稱 PRR)來完成[1]。

目前, 很多模式識別蛋白基因已被分離或克隆,如脂多糖和(或)β-1, 3-葡聚糖識別蛋白、肽聚糖識別蛋白、革蘭氏陰性菌結(jié)合蛋白、C型凝集素、半乳糖苷結(jié)合凝集素、含硫酯鍵蛋白、纖維蛋白素原樣結(jié)構(gòu)域免疫凝集素、清道夫受體和hemolin等[2]。

β-1,3-葡聚糖識別蛋白(beta-1,3-glucan recognition protein, 簡稱 GRP), 又稱β-1,3-葡聚糖結(jié)合蛋白, 與脂多糖葡聚糖結(jié)合蛋白(lipopolysaccharide and beta-1,3-glucan binding protein, 簡稱LGBP)屬于同一基因的不同亞型[3]。兩者已在很多物種中分離或克隆, 主要集中在節(jié)肢動物門(Arthropoda)甲殼綱(Crustacea), 部分軟體動物也有報(bào) 道 ,如 ：βgrp˙˙已 在 歐 洲 龍 蝦(Homarus gammarus)[4]、凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei, 登錄號：AY723297)、斑節(jié)對蝦(Penaeus monodon)[5]、日本囊對蝦(Marsupenaeus japonicus, 登錄號：AB162766)、致倦庫蚊(Culex quinquefasciatus, 登錄號： XM_001845229)、淡水螺(Biomphalaria glabrata,登錄號： EF121825)、太平洋牡蠣(Crassostrea gigas,登錄號： AB377114)、盤鮑(Haliotis discus discus)[2]等中報(bào)道;lgbp已在日本囊對蝦[3]、淡水螯蝦(Pacifastacusleniusculus)[6]、凡納濱對蝦[7]、南美藍(lán)對蝦(Penaeus stylirostris)[8]、中國明對蝦(Fenneropenaeus chinensis)[9]、合浦珠母貝(Pinctada fucata, 登錄號： FJ775601)等中報(bào)道。已有報(bào)道顯示β-1,3-葡聚糖識別蛋白有識別非己物 質(zhì)[10-12], 激活前酚氧化酶系統(tǒng)[6,13-15], 激活凝血級聯(lián)系統(tǒng)[11]和激活導(dǎo)致一系列細(xì)胞毒素因子/細(xì)胞溶解因子/抗菌因子釋放的血細(xì)胞脫粒[16-18]等功能。

雜色鮑(Haliotis disversicolor)是中國南方一種重要的經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖貝類, 然而隨著養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大, 養(yǎng)殖環(huán)境的日益惡化, 再加上種質(zhì)退化現(xiàn)象的出現(xiàn), 各種病害頻繁發(fā)生, 不僅給養(yǎng)殖戶帶來重大的經(jīng)濟(jì)損失, 也成為制約鮑養(yǎng)殖持續(xù)健康發(fā)展的主要因素。本研究從雜色鮑中克隆到β-1,3-葡聚糖識別蛋白并分析經(jīng)副溶血弧菌誘導(dǎo)后saβgrp基因在肝胰臟中的表達(dá)情況, 可為研究軟體動物先天性免疫系統(tǒng)中的免疫識別和信號通路提供良好的參考資料, 也可為開發(fā)新的免疫增強(qiáng)劑提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料和主要試劑

雜色鮑購自廈門培陽水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司, 體長(5.23±0.34)cm, 體質(zhì)量(16.70±2.41)g, 于 25oC 的砂濾海水中暫養(yǎng)3周后用于試驗(yàn)。

總 RNA提取的試劑 RDP由實(shí)驗(yàn)室自行配制;M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶購自Promega公司, 瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自上海捷瑞生物公司, pMD18-T載體連接試劑盒購自大連寶生物公司, DH5α菌株為實(shí)驗(yàn)室自備, SYBR Green Realtime PCR Master Mix試劑購自TOYOBO公司, 1 kb plus DNA Ladder購自天根生化公司。

1.2 雜色鮑副溶血弧菌感染實(shí)驗(yàn)

暫養(yǎng)三周后的雜色鮑首先用不同濃度的副溶血弧菌50 μL進(jìn)行腹足注射, 并用新鮮滅菌海水作為對照, 獲得其半致死濃度為6.7×107cfu/mL。然后設(shè)一個實(shí)驗(yàn)組和一個對照組, 每組3個平行水箱, 每個水箱 20只鮑。實(shí)驗(yàn)組每只注射 50 μL濃度為6.7×107cfu/mL的副溶血弧菌菌液, 對照組每只注射 50 μL的新鮮滅菌海水。分別在腹足注射后的 8、24、48和 96 h采取存活個體的肝胰腺, 用液氮固定后于-80℃保存?zhèn)溆?。副溶血弧?Vibro parahemolyticus)系由廈門大學(xué)張朝霞分離鑒定的鮑病原菌[19], 本課題組曾將之成功應(yīng)用于研究鮑對致病菌和非致病菌的不同反應(yīng)[20]。

1.3 EST序列分析

在對本實(shí)驗(yàn)室所構(gòu)建的雜色鮑肝胰臟 cDNA線性化文庫進(jìn)行大規(guī)模 EST測序的基礎(chǔ)上, 結(jié)合生物信息學(xué)方法初步篩選獲得雜色鮑β-1,3-葡聚糖識別蛋白基因的序列片段, 發(fā)現(xiàn)其與淡水螺、致倦庫蚊、太平洋牡蠣的β-1,3-葡聚糖識別蛋白基因有很高的相似性。

1.4 雜色鮑β-1, 3-葡聚糖識別蛋白基因5’cDNA末端的克隆

使用M13正反向引物對所挑選的EST克隆進(jìn)行重新測序, 已知的序列片段已包含β-1, 3-葡聚糖識別蛋白基因的部分開放閱讀框和 3’非編碼區(qū)。在已知序列的基礎(chǔ)上, 設(shè)計(jì)5’特異性引物進(jìn)行5’cDNA末端的克隆。5’cDNA末端的克隆嚴(yán)格按照 SMART?RACE cDNA amplification kit (Clontech, USA)的說明書進(jìn)行操作, PCR產(chǎn)物使用1%的瓊脂糖電泳檢測,分離純化的目的基因片段連接到 pMD18-T載體上,轉(zhuǎn)化到 DH5α感受態(tài)細(xì)胞中, 挑選陽性克隆進(jìn)行測序, 經(jīng) 3次序列拼接獲得 cDNA全長, 所使用的 5’特異性引物見表1。

1.5 head to toe PCR方法檢測開放閱讀框的序列準(zhǔn)確性

在所獲得的β-1,3-葡聚糖識別蛋白基因 cDNA全長的5’和3’非編碼區(qū)分別設(shè)計(jì)一個正向和反向引物(即βGRP head primer 和βGRP toe primer, 見表1), PCR檢測開放閱讀框的序列準(zhǔn)確性。反應(yīng)程序：94 ℃ 3 min, 94℃ 30 s, 68℃ 30 s, 72℃ 2 min, 35循環(huán); 72℃ 10 min, 4℃ 10 min。回收目的片段轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞中, 挑選陽性克隆進(jìn)行測序。

1.6 生物信息學(xué)分析

使 用 (http：//cn.expasy.org/tools/pi_tool.html.)預(yù)測等電點(diǎn)和分子質(zhì)量。采用SignalP (http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)尋找信號肽序列, 預(yù)測蛋白服務(wù)器 (http：//cubic.bioc.columbia.edu/predictprotein)

預(yù)測蛋白質(zhì)的功能基序。蛋白多重比對使用 Bioedit(http：//www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/)來執(zhí)行。用MEGA 4.0軟件中的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.7 實(shí)時熒光定量PCR

以 SYBR Green I為熒光染料, 采用實(shí)時定量PCR技術(shù)對副溶血弧菌感染后saβgrp基因進(jìn)行表達(dá)分析。通過 ABI公司熒光定量引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)saβgrp和β-肌動蛋白(β-actin)的定量引物(表 1)。PCR擴(kuò)增后電泳檢測無引物二聚體, 測序檢測確保每對定量引物擴(kuò)增出單一的含有已知序列的片段。用 3 μg DNAse處理過的 RNA 作為模板, 按照M-MLV RT Usage information (Promega) 在 20 μL反應(yīng)體系中使用6堿基的隨機(jī)引物進(jìn)行合成cDNA第一條鏈。在實(shí)時定量PCR中, 每個反應(yīng)用相當(dāng)于25 ng RNA逆轉(zhuǎn)錄來的 cDNA, 在 SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems)中進(jìn)行, 并用 ABI 7500 Real Time System 分析。反應(yīng)條件為： 95oC 1 min;(95 oC 15 s; 60 oC 60 s) 40 循環(huán)。分析溶解曲線圖再次確認(rèn)每對定量引物擴(kuò)增出單一的PCR產(chǎn)物。使用相對循環(huán)閾值的方法計(jì)算相對濃度, 以2-ΔΔCT數(shù)值表示saβgpr經(jīng)β-actin內(nèi)校正后的表達(dá)水平 (ΔCT=saβgprCT值-β-actinCT值, ΔΔCT=實(shí)驗(yàn)組樣品ΔCT值-校準(zhǔn)樣品ΔCT值), 每個時相檢測5只鮑魚, 每只鮑魚進(jìn)行 3次技術(shù)重復(fù)。數(shù)據(jù)采用平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤表示。采用 SPSS軟件通過 t-test對ΔΔCT值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,P＜0.05(雙尾檢測法)為差異顯著,P＜0.01為差異極顯著。

表1 本實(shí)驗(yàn)所用引物Tab. 1 Primers used in this study

2 結(jié)果

2.1 5’RACE 結(jié)果

β-1,3-葡聚糖識別蛋白基因5’端cDNA序列經(jīng)3次序列拼接獲得, 3次5’RACE所獲得的目的片段大小依次分別為340 bp、389 bp和484 bp, 第一輪PCR產(chǎn)物沒有明顯特異條帶出現(xiàn), 第二輪 PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖1。

圖1 saβgpr 5’RACE-PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖Fig. 1 The agarose gel electrophoresis of 5’RACE-PCR product of saβgpr

2.2 saβGRP序列分析

將5’RACE獲得的3個saβgrp基因片段和來自文庫的 EST序列片段進(jìn)行拼接, 得到 1 459 bp的saβgrp基因全長cDNA序列(Genbank accession No.FJ755187), 且經(jīng)head to toe PCR 方法檢測開放閱讀框序列準(zhǔn)確無誤。該序列包括387 bp的5’非編碼區(qū),987 bp的開放閱讀框和85 bp的3’非編碼區(qū)。3’非編碼區(qū)有兩個典型的polyA加尾信號。

saβgrp開放閱讀框序列可編碼 328個氨基酸,預(yù)測分子量為36.9 KDa, 等電點(diǎn)為5.90。SingalP軟件分析發(fā)現(xiàn)saβGRP無信號肽。推測的氨基酸序列用Predict Protein軟件分析發(fā)現(xiàn)saβGRP含有以下位點(diǎn)和基序(圖2)： 一個蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn), 一個β-1,3-葡聚糖酶位點(diǎn)(Trip-Glu-Ile-Asp, 即 W144-E149-I150-D151), 一個β-1,3-多糖連接識別基序(F202-G220),一個多糖結(jié)合基序(V119-P136)和一個葡聚糖酶基序(W144-A155)。此外, saβGRP沒有蝦βGRP特有的細(xì)胞粘著位點(diǎn) RGD(Arg-Gly-Asp), 而在氨基酸序列的124位置發(fā)現(xiàn)EGD(Glu-Gly-Asp)。

圖2 saβgrp基因全長cDNA序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列Fig. 2 The full length cDNA sequence and deduced amino acid sequence of saβgrp

另外, 挑選包括雜色鮑在內(nèi)的 9個無脊椎動物的β-1,3-葡聚糖識別蛋白的氨基酸序列, 采用Bioedit軟件進(jìn)行多重序列比對(圖3), 發(fā)現(xiàn)雜色鮑的序列稍微不同于其他物種的序列, N端序列短于其他物種。盡管一些保守的基序均能在序列中發(fā)現(xiàn), 但是氨基酸序列長度因物種不一樣而有差異。

采用 MEGA 4.0軟件, 以鄰位相連法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖 4)。軟體動物和節(jié)肢動物分成兩個支, 然而雜色鮑自成一支。

圖3 雜色鮑和其他物種βGRP氨基酸序列的多重比較Fig. 3 Multiple alignment of the βGRP amino acid sequences of Haliotis diversicolor and other species

2.3 副溶血弧菌感染后saβgrp基因的表達(dá)結(jié)果

經(jīng)副溶血弧菌誘導(dǎo)后,saβgrp在肝胰臟中的表達(dá)結(jié)果見圖 5。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示, 24 h的實(shí)驗(yàn)組saβgrp表達(dá)水平極顯著高于對照組(P＜0.01), 48 h的實(shí)驗(yàn)組saβgrp表達(dá)水平顯著高于對照組(P＜0.05),其他時相的對照組和實(shí)驗(yàn)組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

3 討論

本研究結(jié)合EST序列分析和SMART RACE技術(shù)克隆獲得雜色鮑的β-1,3-葡聚糖識別蛋白基因,saβGRP同其他物種的β葡聚糖識別蛋白一樣, 都含有一個糖苷水解酶16超家族結(jié)構(gòu)域, 同屬于糖苷水解酶16超家族成員。另外, saβGRP與節(jié)肢動物及軟體動物其他物種的同源氨基酸之間的多重序列比對結(jié)果(圖3)顯示, 除了稍微的差異外, 主要的序列基序很保守, 并未因物種不同而有很大的變化, 因而可以推測這些基序的功能保守性。葡聚糖酶催化活性所必需的4個氨基酸殘基(Trp-Glu-IIe-Asp, WEID)[2-3,7,9]均存在于 saβGRP的序列中。雖然沒在 saβGRP序列中發(fā)現(xiàn)蝦類葡聚糖識別蛋白特有的細(xì)胞粘著位點(diǎn)RGD[3,7-9], 但發(fā)現(xiàn)了谷氨酸、甘氨酸、天冬氨酸 3個氨基酸殘基(Glu-Gly-Asp, EGD)。此外, 識別和水解碳水化合物的活化位點(diǎn), 多糖結(jié)合基序(V119-P136)和葡聚糖酶基序(W144-A155)以及識別和結(jié)合多糖所必需的β-1,3-多糖連接識別基序(F202-G220)也均存在于 saβGRP的序列中[2-3,7-9]。

圖4 雜色鮑和其他物種βGRP氨基酸序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 4 Phylogenetic tree of the βGRP amino acid sequences of Haliotis diversicolor and other species

圖5 副溶血弧菌感染后 saβgrp基因在肝胰臟中的表達(dá)水平Fig. 5 The expression of saβgrp in response to V. parahaemolyticus challenge (with β-actin as endogenous control).

然而, 作者推測saβGRP可能為一種新型的β葡聚糖識別蛋白,分類地位屬于同一屬的雜色鮑和皺紋盤鮑, 系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖 4)顯示雜色鮑的β葡聚糖識別蛋白同皺紋盤鮑的該基因不屬于同一支, 且與其他物種的β葡聚糖識別蛋白之間存在較遠(yuǎn)的進(jìn)化距離。saβGRP與現(xiàn)有報(bào)道的β-1,3-葡聚糖識別蛋白N端均含信號肽不同, 其 N端不含信號肽, 是一個非分泌型蛋白。淡水螺β葡聚糖識別蛋白的N端也未含信號肽, 但相關(guān)的結(jié)構(gòu)和功能分析未見報(bào)道,系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示其與saβGRP不在一個分支。在盤鮑和蝦類的β葡聚糖識別蛋白氨基酸序列中均可發(fā)現(xiàn)的1～2個N糖基化位點(diǎn)[2-3,7-9], 在saβGRP的氨基酸序列中不存在。皺紋盤鮑和部分蝦類的β葡聚糖識別蛋白含有脂多糖結(jié)合基序[2,7-9], 在saβGRP的氨基酸序列中也未發(fā)現(xiàn)。

病毒和細(xì)菌是導(dǎo)致雜色鮑大量死亡的主要病原,且目前分離鑒定到的細(xì)菌大多為弧菌, 因此作者選擇副溶血弧菌進(jìn)行雜色鮑感染應(yīng)激實(shí)驗(yàn)。實(shí)時定量PCR結(jié)果顯示, 24 h的實(shí)驗(yàn)組saβgrp表達(dá)水平極顯著高于對照組(P＜0.01), 48 h的實(shí)驗(yàn)組雜色鮑saβgrp表達(dá)水平顯著高于對照組(P＜0.05), 此結(jié)果表明saβGRP是一種急性誘導(dǎo)蛋白, 可快速識別入侵的副溶血弧菌, 在雜色鮑的先天性免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要的作用。類似的現(xiàn)象也在其他物種的β葡聚糖識別蛋白中發(fā)現(xiàn), 如日本囊對蝦[3]、凡納濱對蝦[7]、中國明對蝦[9]LGBP和皺紋盤鮑βGRP[2]在不同細(xì)菌或細(xì)菌毒素的感染下, 其表達(dá)量均可見升高; 半定量結(jié)果也顯示家蠶(Bombyx mori)[21]和白腹叢蚊(Armigeres subalbatus)[22]βGRP在不同病原菌的感染下表達(dá)升高。

總之, 作者從雜色鮑中克隆到一新型β-1,3-葡聚糖識別蛋白基因, 實(shí)時定量PCR結(jié)果表明saβGRP是一種急性誘導(dǎo)蛋白, 可在先天性免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要的作用, 這為研究雜色鮑抗病防御分子機(jī)制提供了參考資料, 且為防治鮑大規(guī)模暴發(fā)性死亡提供科學(xué)的依據(jù)。

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Molecular cloning and characterization of beta-1, 3-glucan recognition protein from small abaloneHaliotis diversicolor

WANG Bao-zhen1, ZHANG Zi-ping2, WANG Yi-lei1, WANG Guo-dong1, ZOU Zhi-hua1, WANG Shu-hong1, JIA Xi-wei1
(1. Key Laboratory of Science and Technology for Aquaculture and Food Safety of Fujian Province University,Fisheries College, Jimei University, Xiamen 361021, China; 2. Department of Chemistry and Biochemistry,Texas State University, 601 University Drive, San Marcos, TX 78666, USA)

Dec., 15, 2009

saβgrp;Vibrio parahaemolyticus;Haliotis disversicolor

The cDNA of the beta-1,3-glucan recognition protein in small abaloneHaliotis diversicolor(saβgrp)was cloned. It was originally identified from an expressed sequence tag (EST) fragment in a normalized cDNA library. Its 5’ cDNA end was obtained by 5’ rapid amplification of cDNA end (RACE) techniques and its complete sequence was confirmed by head to toe PCR. The full length cDNA ofsaβgrpwas of 1459 bp, consisting of a 5’-terminal UTR of 387 bp, an open reading frame of 987 bp, and a 3’-terminal UTR of 85 bp. The deduced protein was composed of 328 amino acids, with an estimated molecular weight of 36.9 kDa and a predicted pI of 5.90. Different from other reported GRPs that contain a signal peptide, the putative saβGRP does not contain a signal peptide and thus belongs to non-secretary proteins. Real time quantitative PCR analysis revealed that afterVibrio Parahaemolyticusinjection, the expression level ofsaβgrpin hepatopancreases at 24 h was most significantly higher than that of the control group (P＜0.01), while at 48 hour post-injection, it was significantly higher than that of the control group (P＜0.05).

Q751

A

1000-3096(2011)08-0067-09

2009-12-15;

2011-03-02

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(20877034); 福建省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2009J0102); 福建省教育廳A類項(xiàng)目(JA08137); 集美大學(xué)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)基金資助項(xiàng)目(2010A001)

王寶珍(1984-), 女, 福建晉江人, 碩士, 主要從事水產(chǎn)動物功能基因和基因組學(xué)的研究, 電話： 0592-6182723, E-mail：bzwang1984@hotmail.com; 王 藝 磊 ,通 信 作 者 , E-mail： ylwang@jmu.edu.cn

譚雪靜)