王妍妍, 李貴陽, 李 杰, 肖 鵬, 莫照蘭

(1．中國科學院 海洋研究所 實驗海洋生物學重點實驗室, 山東 青島266071; 2．中國科學院 研究生院, 北京 100049)

遲緩愛德華氏菌OppA蛋白的免疫原性及免疫保護分析

王妍妍1,2, 李貴陽1,2, 李 杰1,2, 肖 鵬1, 莫照蘭1

(1．中國科學院 海洋研究所 實驗海洋生物學重點實驗室, 山東 青島266071; 2．中國科學院 研究生院, 北京 100049)

遲緩愛德華氏菌(Edwardsiella tarda)是水產(chǎn)養(yǎng)殖動物重要的病原菌, 引起魚類愛德華氏菌病, 免疫防治是針對該病的一個有效途徑。OppA是遲緩愛德華氏菌的一個寡肽透過酶組分, 作者開展OppA的免疫原性及免疫保護性的研究, 旨在評價其作為魚類愛德華氏菌病疫苗候選抗原的可行性。將致病性的遲緩愛德華氏菌LSE40的oppA克隆于表達載體pPROEXHTa, 轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3), 表達重組蛋白6His-OppA, 并利用Ni-NTA SefinoseTMkit進行純化。以純化的6His-OppA兩次注射免疫大菱鲆(Scophthalmus maximus), 第34天后檢測血清抗體效價為1： 1024; 以LSE40對免疫的大菱鲆進行人工感染, 測得免疫保護率是25.9%。結(jié)果表明, OppA可刺激大菱鲆產(chǎn)生免疫應答, 并具有免疫保護效果。

遲緩愛德華氏菌(Edwardsiella tarda); OppA; 原核表達; 免疫應答; 免疫保護

遲緩愛德華氏菌(Edwardsiella tarda)是一種革蘭氏陰性細菌, 能引起水生動物發(fā)病, 感染海水和淡水魚類引起的疾病稱為愛德華氏菌病(Edwardsiellosis), 給養(yǎng)殖業(yè)帶來重大經(jīng)濟損失[1-4]。利用疫苗預防愛德華氏菌病的研究已取得一些進展,滅活菌體、細胞碎片、表面脂多糖等菌體成分具有良好的免疫原性[5-7], 亞單位疫苗、減毒疫苗、DNA疫苗顯示了良好的免疫保護[8-14]。由于遲緩愛德華氏菌存在血清型差異, 導致一些疫苗的應用效果不穩(wěn)定。篩選具有交叉保護作用的抗原是解決這個問題的一條有效途徑。

細菌的寡肽透過酶(Oligopeptide permease, 簡稱Opp)由 OppABCDF 5個蛋白構(gòu)成, 主要負責依賴ATP水解的寡肽營養(yǎng)攝取[15]。革蘭氏陰性菌的OppA作為底物結(jié)合蛋白, 能結(jié)合多種形式的寡肽, 為細菌提供營養(yǎng)[16], 還可作為細胞膜受體, 參與其他生理過程的調(diào)控, 如密度感應[17], 孢子形成[18], 抗生素抗性[19], 菌膜形成[20], 細胞黏附[21], 胞內(nèi)寄生[22]等。一些研究顯示, 同種細菌的OppA高度保守, 作為抗原具有較好的免疫原性, 能夠不同程度地誘導宿主產(chǎn)生免疫應答, 提高宿主針對相應病原的免疫保護力[23-26]。根據(jù) NCBI已公布的基因組序列信息,愛德華氏菌屬的 OppA氨基酸序列間相似度較高,分布在92%～99%。因此, OppA可能是一個抵抗愛德華氏菌病的良好的交叉保護性抗原。在前期工作中, 本實驗室從遲緩愛德華氏菌LSE40 fosmid文庫克隆得到編碼寡肽透過酶的opp基因簇[27]。本研究通過體外表達遲緩愛德華氏菌OppA, 評價該蛋白在大菱鲆(Scophthalmus maximus)中的免疫原性和免疫保護效果。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒、培養(yǎng)基

遲緩愛德華氏菌LSE40由本實驗室從患病大菱鲆體內(nèi)分離保存[8]; 克隆載體 pEASY-T1(氨芐青霉素抗性)和大腸桿菌Trans-T1購自北京全式金生物技術(shù)有限公司, 表達載體 pPROEXHTa(氨芐青霉素抗性)來自 Invitrogen公司; 大腸桿菌 BL21(DE3)購自天根生化科技(北京)有限公司; 胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基(液體 TSB和固體 TSA)用于培養(yǎng)遲緩愛德華氏菌, LB培養(yǎng)基用于培養(yǎng)大腸桿菌; 氨芐青霉素(Amp)的使用質(zhì)量濃度為100 mg/L。

1.2 實驗動物

大菱鲆購自山東青島膠南養(yǎng)殖場, 體長6～8 cm,體質(zhì)量15 g左右, 暫養(yǎng)于通氣的水族箱, 水溫16～18℃, 每隔兩天換水和投喂餌料。實驗前隨機選取3尾魚, 取血清與遲緩愛德華氏菌 LSE40做血清凝集實驗; 同時取魚的內(nèi)臟器官勻漿涂布于 TSA平板進行細菌分離。在確定未出現(xiàn)凝集反應以及未分離到細菌的情況下, 該批魚方能進行后續(xù)實驗。

1.3 OppA表達載體的構(gòu)建

根據(jù)遲緩愛德華氏菌 LSE40的opp基因簇序列[27]設計上游引物 OppA-EcoRI-F(5′-TGAGAATTCGCCGAGGTTCCGGCCGGTGTA-3′,下 劃 線 為EcoRI內(nèi)切酶位點)和下游引物 OppA-XhoI-R(5′-GCCTCGAGCACGACGCGCAATTAATGTTGAA CG-3′, 下劃線為XhoI內(nèi)切酶位點), 擴增oppA基因的1583 bp片段, 該片段去除了編碼OppA N端信號肽的81 bp。所得PCR產(chǎn)物克隆到pEASY-T1載體,轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans-T1,在LB+Amp固體平板培養(yǎng)基上進行藍白斑篩選, 挑取白色菌落經(jīng)擴大培養(yǎng), 提質(zhì)粒進行EcoRI/XhoI雙酶切, 選擇插入片段大小符合的陽性重組質(zhì)粒送上海博尚生物技術(shù)有限公司進行測序。確認克隆序列的正確后, 將插入片段連接到表達載體 pPROEXHTa, 轉(zhuǎn)化大腸桿菌 BL21(DE3),經(jīng) LB+Amp培養(yǎng)基篩選陽性菌落, 進行擴大培養(yǎng),提取質(zhì)粒經(jīng)EcoRI/XhoI雙酶切和 OppA-EcoRIF/OppA-XhoI-R為引物的PCR擴增鑒定插入片段。含有正確重組質(zhì)粒的菌株命名為BL21/HtaOppA; 同時將空質(zhì)粒pPROEXHTa轉(zhuǎn)化到BL21(DE3), 獲得對照菌株BL21/Hta。

1.4 OppA重組蛋白的誘導表達及純化

以37℃、1 mmol/L IPTG誘導培養(yǎng)BL21/ Hta-OppA, 同時設 BL21/HtaOppA 未誘導對照及BL21/Hta空質(zhì)粒對照, SDS-PAGE(12%分離膠和5%濃縮膠)檢測目的蛋白表達情況。對 BL21/HtaOppA進行表達條件的優(yōu)化, 設置條件為： IPTG誘導濃度0.8、0.4、0.2 mmol/L, 誘導溫度 20、26、30、37℃,誘導時間3、4、5 h, 3要素形成36個組合。每組實驗均以BL21/Hta為對照。誘導培養(yǎng)的細菌菌液經(jīng)超聲波破碎、離心, SDS-PAGE檢測上清和沉淀, 根據(jù)蛋白表達量的情況確定其中最優(yōu)的誘導條件組。按照優(yōu)化的誘導表達條件對 BL21/HtaOppA大量培養(yǎng)(300 mL), 5 000g離心6 min收集菌體, 以Ni-NTA SefinoseTMkit(BIO BASIC INC.)純化目的蛋白。以SDS-PAGE檢測純化效果, 以 Bradford蛋白質(zhì)定量試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)測定純化蛋白濃度。

1.5 免疫實驗

將大菱鲆隨機分成免疫組和對照組, 每組 30尾。純化的OppA重組蛋白6His-OppA與等體積完全弗氏佐劑(Sigma)混合, 以 30 μg 6His-OppA/尾魚的劑量, 對免疫組進行腹腔注射免疫; 對照組則以等體積 PBS代替 6His-OppA, 其他條件與免疫組相同。第16天進行二次免疫, 此時改用不完全弗氏佐劑, 其他處理方法與第一次相同。

二次免疫后第34天, 免疫組和對照組分別隨機挑取3尾魚, 取血清, 對照組血清作為陰性對照, 以間接ELISA方法檢測免疫組血清抗體效價[28]。其余的魚以濃度為2.73×104cfu/尾的LSE40進行腹腔注射攻毒。觀察并記錄死魚數(shù)量, 根據(jù)公式計算免疫保護率：

免疫保護率=(1-免疫組死亡率/對照組死亡率)×100%[29]。

2 結(jié)果

2.1 OppA表達載體構(gòu)建

圖1 重組表達菌株BL21/HtaOppA的構(gòu)建和鑒定Fig. 1 Construction and identification of recombinant strain BL21/HtaOppA

以篩選的BL21/HtaOppA作菌落模板, 以OppAEcoRI-F/OppA-XhoI-R擴增得到的片段大小為1.6 kb左右(圖1a)。該DNA片段去除了OppA蛋白N端27個氨基酸的信號肽編碼區(qū), 目的是提高 6His-OppA在大腸桿菌的表達量。同時, BL21/HtaOppA中的質(zhì)粒經(jīng)EcoRI/XhoI雙酶切產(chǎn)生1.6 kb左右的DNA片段(圖 1b), 與預期的片段大小一致, 表明成功獲得OppA重組表達菌株BL21/HtaOppA。

2.2 OppA重組蛋白的誘導表達及條件優(yōu)化

實驗中發(fā)現(xiàn), 經(jīng)1 mmol/L IPTG、37 ℃條件誘導的BL21/HtaOppA, 6His-OppA成功表達(圖2a), 但是主要以包涵體形式存在于細胞沉淀, 只有 30%左右的可溶蛋白存在于細胞上清。為提高可溶蛋白含量, 作者優(yōu)化了細菌的培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間和 IPTG誘導濃度, 優(yōu)化得到的條件為： 在26 ℃培養(yǎng)條件下,以 0.4 mmol/L IPTG誘導4 h, 此時約有80%的可溶性重組蛋白存在于細胞破碎物的上清(圖 2b), 經(jīng)純化, 獲得了高純度的目的蛋白(圖2c)。

2.3 血清抗體效價及免疫保護率

大菱鲆經(jīng)兩次免疫, 在加強免疫后的第 34天,檢測得到的免疫大菱鲆血清抗體效價是1：1 024。免疫組和對照組經(jīng)LSE40毒株攻毒, 如圖3所示, 對照組于攻毒后的第 8天開始出現(xiàn)死亡, 免疫組于攻毒后的第11天開始出現(xiàn)死亡; 在攻毒后第22天, 兩組累積死亡率均趨于穩(wěn)定, 此時免疫組累積死亡率為74.1%, 對照組為 100%, 且免疫組死亡時間明顯延后(P＜0.01), 計算得到的免疫保護率是25.9%。

圖2 SDS-PAGE檢測OppA重組蛋白的表達及純化Fig. 2 SDS-PAGE of 6His-OppA in bacteria lysates and in elution buffer

圖3 以遲緩愛德華氏菌LSE40攻毒后的大菱鲆累積死亡率Fig. 3 Accumulative mortalities of turbot after challenged with E. tarda LSE40

3 討論

本研究利用大腸桿菌表達菌株 BL21(DE3), 將遲緩愛德華氏菌 OppA蛋白編碼基因克隆到表達質(zhì)粒 pPROEXHTa的 6His標簽之后, 獲得重組蛋白6His-OppA。由于誘導表達的目的蛋白主要以包涵體形式存在, 蛋白純化過程中需經(jīng)變性和復性處理,將會增加操作難度, 所以我們進行了表達條件的優(yōu)化。通過降低誘導時的培養(yǎng)溫度以及IPTG濃度, 有效減少包涵體生成, 使可溶性蛋白含量由 30%提高到80%。

本實驗表明, 遲緩愛德華氏菌 OppA重組蛋白作為抗原, 能使大菱鲆產(chǎn)生特異性免疫應答, 并起到一定的免疫保護作用, 這與鼠疫耶爾森菌(Yersinia pestis)和卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis)的 OppA蛋白免疫小鼠的結(jié)果較一致[23,26]。根據(jù)結(jié)果, 本實驗從免疫魚獲得的血清抗體效價(1： 1 024)低于鼠疫耶爾森菌和卡他莫拉菌的 OppA免疫小鼠獲得的血清抗體效價(1： 10 000～1： 32 000)。這種血清抗體效價的差異可能是因為大菱鲆與小鼠相比,免疫系統(tǒng)相對不完善, 免疫應答能力比小鼠弱。另外,體外表達抗原的結(jié)構(gòu)變化、免疫劑量、免疫佐劑類型以及免疫途徑等, 都可能導致免疫應答水平和免疫保護效果的不同[26]。最近的一個研究顯示, 通過黏膜免疫途徑免疫卡他莫拉菌的 OppA蛋白, 提高了小鼠清除肺部致病性病原的能力[23]。

ABC輸送器家族蛋白被認為是潛在的針對病原菌的疫苗候選抗原或藥物作用靶點[24]。Opp為ABC輸送器家族的一員, 其在抵抗病原侵染方面的功能日益受到人們的關(guān)注。通過本實驗得到的初步結(jié)果,OppA在大菱鲆顯示了一定的免疫應答和免疫反應。作者下一步將在免疫劑量、免疫佐劑類型以及免疫途徑等方面開展工作, 以期提高該蛋白的免疫應答和免疫保護力, 達到控制愛德華氏菌病的目的。

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Immunogenicity and immunoprotection of oligopeptide permease A (OppA) ofEdwardsiella tarda

WANG Yan-yan1,2, LI Gui-yang1,2, LI Jie1,2, XIAO Peng1, MO Zhao-lan1
(1. Institution of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China; 2. Graduate School,Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)

Feb., 22, 2011

Edwardsiella tarda; OppA; Prokaryotic expression; Immune response; Immunoprotection

Edwardsiella tardais an important pathogen to aquaculture animals, causing fish edwardsiellosis diseases. Vaccination is an efficient protection against this disease in fish. OppA is a component of the oligopeptide permease system ofE. tarda. We evaluated the potential of OppA as an antigenic candidate vaccine against edwardsiellosis. TheoppAgene was cloned into expression vector pPROEXHTa and expressed inE. coliBL21 (DE3).The expressed 6His-OppA was purified with Ni-NTA SefinoseTMKit and used as an antigen to immunize turbot(Scophthamus maximus) twice. At day 34 post-vaccination, the serum antibody titer in the immunized fish was 1：1024, and the relative percentage survival (RPS) was 25.9% when the immunized turbot was challenged with pathogenicE. tarda. The present studies indicate that OppA ofE. tardacan induce immune response in fish and provide protection against edwardsiellosis.

Q939.91

A

1000-3096(2011)05-0019-05

2011-02-22;

2011-03-22

國家自然科學基金項目(31072245); 國家鲆鰈類產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項目(NYCYTX-50); 青島市科技發(fā)展計劃項目(08-1-7-2-HY)

王妍妍(1987-), 女, 山東濟寧人, 碩士, 主要從事海洋微生物與水產(chǎn)動物病害防治研究, E-mail： wyy8701@163.com; 莫照蘭,通信作者, 電話： 0532-82898561, E-mail： zhlmo@qdio.ac.cn

譚雪靜)