文 菁, 胡超群, 范嗣剛

(1．湛江師范學院 生命科學與技術學院, 廣東 湛江 524048; 2．中國科學院 南海海洋研究所, 中國科學院海洋生物資源可持續(xù)利用重點實驗室, 廣東省應用海洋生物學重點實驗室, 廣東 廣州 510301)

中國15種海參的分子系統(tǒng)發(fā)育和骨片演化的分析

文 菁1,2, 胡超群2, 范嗣剛2

(1．湛江師范學院 生命科學與技術學院, 廣東 湛江 524048; 2．中國科學院 南海海洋研究所, 中國科學院海洋生物資源可持續(xù)利用重點實驗室, 廣東省應用海洋生物學重點實驗室, 廣東 廣州 510301)

基于線粒體16S rRNA基因部分序列, 對我國15種海參的分子系統(tǒng)發(fā)育進行了分析。結果表明,片段長度約為 570bp, A+T的平均含量為 54.7%。15種海參的遺傳距離在 0.041(花刺參與糙刺參)至0.327(紅腹海參與花刺參)之間, 不同海參種類間的遺傳距離差別很大。NJ和MP聚類分析方法一致, 符合傳統(tǒng)的形態(tài)學分類結果。刺參科、海參科、刺參屬、梅花參屬和輻肛參屬均呈單態(tài)性。利用系統(tǒng)發(fā)育方法對刺參科與海參科內骨片的進化關系進行了推斷, 發(fā)現桌形體和扣狀體是較原始的骨片類型,隨后進化為桿狀體和花紋樣體。

海參; 16S rRNA基因; 系統(tǒng)發(fā)育; 骨片演化

海參是棘皮動物門(Echinodermata)、海參綱(Holothuroidea)的海洋無脊椎動物。全世界約有1 400種海參, 分屬于25科和160屬[1], 我國約有140余種海參[2]。海參是名貴的珍饈海味, 名列于八大海珍之中, 具有較高的食用價值和藥用價值, 自古以來就受到亞洲尤其是我國人民的青睞。世界范圍內可供食用的海參有50余種[3], 我國有20余種, 除了仿刺參(Apostichopus japonicus), 絕大部分分布于我國南海的亞熱帶和熱帶海域[2]。

海參骨片是位于海參真皮表層的內骨骼, 是海參的重要分類特征。根據傳統(tǒng)分類學, 海參骨片用于在科的水平對海參種類進行鑒定和區(qū)分[4]。Samyn等[5]利用海參骨片的種類和形態(tài), 對海參科海參屬麥太森亞屬(Mertensiothuria)進行了重新鑒定和分類,認為該亞屬中的海參骨片有一定的共性。廖玉麟[2]曾對我國的 134種海參進行過形態(tài)學的分類, 并對其骨片進行了較詳細的描述。文菁[6]和范嗣剛等[7]分別運用掃描電子顯微鏡對我國南海海參的骨片形態(tài)及結構進行觀察, 豐富了海參骨片的形態(tài)學研究信息。國外學者認為海參的骨片與物種的進化有直接關系, Rowe認為海參骨片類型由簡單到復雜是進化的過程, 如由桿狀體和花紋樣體進化到桌形體和扣形體; 但 Levin[8]的結論則與之相反, 認為骨片進化是由復雜到簡單的過程。像其他棘皮動物一樣, 有關海參的化石記錄很少, 因此從形態(tài)學角度確定海參物種間的進化關系缺乏足夠的證據[4]。

越來越多的研究表明, 線粒體DNA是進行物種系統(tǒng)發(fā)育分析的有效分子標記。目前, 已有國內外學者對海參的分子系統(tǒng)發(fā)育和種群遺傳多態(tài)性進行了研究, Arndt等[4]采用16S rRNA 和COI片段對瓜參科的科、屬系統(tǒng)水平發(fā)生進行了研究; Kerr等[8]用16S rRNA對海參科內5個屬之間的親緣關系進行了研究; 李穎等[9]基于 16S rRNA 和 COI片段對仿刺參的系統(tǒng)發(fā)育和遺傳多樣性進行了研究。利用分子系統(tǒng)發(fā)育方法來分析不同海參骨片的形態(tài)差異, 可以為海參骨片形態(tài)的進化關系提供有力證據[8]。因此,本研究基于海參線粒體 16S rRNA基因, 對我國 15種經濟海參進行了系統(tǒng)發(fā)育分析, 并以此推斷海參骨片的進化關系。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

14種熱帶海參分別取自廣西潿洲島、海南島三亞和西沙群島, 仿刺參由大連莊河新華水產有限公司仿刺參養(yǎng)殖基地提供, 完整的海參個體用無水乙醇固定后運回實驗室, 15種海參均屬于海參綱(Holothuroidea)楯手目(Aspidochirotida), 物種鑒定參照廖玉麟[2]和Massin[10]的描述, 基本信息見表1。

表1 15種海參名稱和來源Tab. 1 Names and sources of 15 sea cucumber species

1.2 DNA提取

剪取海參樣品體壁組織約 30 mg, 用雙蒸水洗凈, 滅菌吸水紙吸干水分, 按照 TIANamp海洋動物DNA 提取試劑盒(北京天根生物技術有限公司)提取樣品DNA, 溶解于50 μL TE, －20℃保存。

1.3 聚合酶鏈式反應(PCR)

參 照 Kerr[8]的 引 物 (16Sar： 5′-CGCCTGTTTATCAAAAACAT-3′, 16Sbr： 5′-CTCCGGTTTGAACTCAGATCA-3′), 以基因組 DNA為模板, 擴增海參樣品線粒體16S rRNA基因片段。反應體系： 總反應體積 50 μL, 包括 10×PCR 緩沖液 5 μL(內含 Mg2+50 mmol/L)、dNTPs l μL (10 mmol/L)、每種引物 2 μL (10 μmol/L )、DNA 模板 40 ng、Taq酶 0.5 μL (2 U/μL), 滅菌的雙蒸水補充至50 μL。PCR反應程序為： 95℃變性30 s, 然后95℃ 30 s、50℃退火30 s、72℃ 1 min,經40個循環(huán), 72℃延伸4 min。

1.4 PCR產物檢測, 純化, 測序

參照Wen[11]的方法, 取5 μL PCR產物, 用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳成像檢測。電泳產物用AxyPrepTMDNA 膠回收試劑盒(Axygen, 美國)純化, 然后送上海英維捷基生物有限公司進行雙向測序。

1.5 數據處理

雙向測序后用DNASTAR和Clustal X軟件進行拼接和比對, 剪切引物序列, 用MEGA 4.1軟件分析它們的堿基組成和遺傳距離, 從 GenBank中選取海膽Arbacia lixula(序列號 X80396)為外群, 運用PHYLIP軟件包進行海參分子系統(tǒng)發(fā)育的分析, 通過鄰接法(NJ)和最大簡約法(MP)構建系統(tǒng)樹。自展(Bootstrap)法檢測系統(tǒng)樹的置信度, 重復數為1000。系統(tǒng)樹用TREEVIEW程序進行構圖, 刺參科和海參科種類的骨片進化樹根據海參線粒體 16S rRNA基因部分序列的NJ系統(tǒng)樹繪制。各種海參的不同骨片形態(tài)根據廖玉麟[2]和Massin[10]的描述。

2 結果

2.1 測序結果

用引物對16Sar和16Sbr能夠容易地從所有樣品中擴增出約570 bp大小的線粒體16S rRNA基因片段。產物經純化和測序后, 序列簡單而明晰, 種內擴增 16S rRNA 基因只得到一種單倍型, 序列遞交到NCBI的GenBank數據庫, 序列號見表2。

表2 15種海參16S rRNA基因片段長度和堿基組成Tab. 2 Lengths and base contents of 16S rRNA gene fragments

2.2 堿基組成

經比對發(fā)現, 15種海參16s rRNA基因片段序列存在保守位點 281個(51.6%), 多態(tài)位點 261個(47.9%), 簡約信息位點214個(39.3%)。平均堿基組成中含25.0%的T, 23.4%的C, 29.7%的A, 21.8%的G, A+T的平均含量為54.7%, 高于G+C的平均含量(表 2)。

2.3 遺傳距離

利用Kimura雙參數法, 以轉換加顛換計算相對遺傳距離顯示, 15種海參的遺傳距離在0.041(花刺參與糙刺參)至 0.327(紅腹海參與花刺參)之間(表 3)。對15種海參遺傳距離的比較發(fā)現, 不同海參種類間的遺傳距離差別很大。刺參屬內的遺傳距離為0.041～0.116, 梅花參屬內的遺傳距離為 0.095, 輻肛參屬內的遺傳距離為 0.100, 海參屬內的遺傳距離為0.126～0.213。在科水平內, 刺參科內的遺傳距離為0.041～0.216, 海參科內的遺傳距離為 0.100～0.278。海參科與刺參科之間的遺傳距離為0.243～0.327。

2.4 分子系統(tǒng)發(fā)育樹

圖1顯示了根據遺傳距離構建的NJ和MP系統(tǒng)樹, 兩種分析方法的結果一致, 7種刺參科種類聚為一簇, 8種海參科種類聚為一簇。并且刺參屬、梅花參屬和輻肛參屬都顯示明確的單態(tài)性, 置信度都在98以上。

2.5 骨片進化樹

根據NJ系統(tǒng)發(fā)育樹構建的骨片進化樹以及前人學者對海參骨片的描述[2,10], 在刺參科內, 刺參屬的種類和仿刺參屬具有桌形體, 而梅花參屬的種類具有桿狀體, 沒有桌形體, 刺參屬的種類聚為一簇, 仿刺參屬和梅花參屬聚為一簇; 刺參屬的種類具有 C形體和花紋樣體, 聚為一簇, 仿刺參屬和梅花參屬的種類均沒有C形體和花紋樣體, 聚為一簇(圖2)。在海參科內, 海參屬的種類具有桌形體, 聚為一簇,而白尼參屬的蛇目白尼參和輻肛參屬的種類沒有桌形體, 兩者聚為一簇; 玉足海參、象牙海參和糙海參具有扣狀體, 其余5種海參科種類沒有扣狀體; 白尼參屬的蛇目白尼參和輻肛參屬的種類有花紋樣體,除了黑海參, 其余 4種海參屬種類均沒有花紋樣體(圖 3)。

3 討論

3.1 海參線粒體16S rRNA基因

?

本研究充分考慮到線粒體 16S rRNA基因作為分子標記用于分析海參系統(tǒng)發(fā)育的適合性。線粒體基因比核基因進化速度快, 16S rRNA基因相對于其他線粒體基因來說在種類極其保守[9]。Arndt等研究東太平洋 15種海參的系統(tǒng)發(fā)育和親緣關系時指出,16S rRNA基因相對于 COI基因, 在種內更加保守,非常適合種間關系的研究, 能夠被用來區(qū)分親緣關系較近的物種[4]。而且, 線粒體 DNA作為獨立的核外遺傳物質, 在細胞內具有很高的拷貝數, 閉合雙環(huán)的結構使得線粒體 DNA更加穩(wěn)定, 因此, 相對于核基因組DNA來說, 線粒體DNA序列能夠更加容易的擴增獲得。

圖1 基于海參16S rRNA基因片段的NJ和MP系統(tǒng)樹Fig.1 Molecular phylogenetic tree of sea cucumbers based on NJ and MP analyses of 16S rRNA gene sequences.節(jié)點上的數字為 1000次重復的 Bootstrap值, 縮寫見表 1,Ar.lixula 為外群Numbers above branches indicate bootstrap proportions (percentage of 1000 replicates) based on NJ and MP analyses. Genera abbreviations are as given in the legend of Tab.1, Ar.lixula was outgroup

15種海參中, A+T的平均含量為 54.7%, 高于G+C的含量, 這與其他學者在海參線粒體DNA序列研究中得到的 A+T含量高于 G+C含量的結果相一致[4,8-9,12]。從遺傳距離可以看出, 海參科與刺參科之間的遺傳距離大于刺參科內的遺傳距離, 存在海參科內的遺傳距離大于兩科之間的遺傳距離的現象。Kerr[13]等曾對海參科與刺參科種類的47種形態(tài)學特征進行研究, 發(fā)現兩者除了刺參科種類具有發(fā)達的疣足外, 其余46種形態(tài)學特征存在共性[13]。除了不同屬的玉足海參(海參屬)與蛇目白尼參(白尼參屬)的遺傳距離(0.211)大于同屬(海參屬)的紅腹海參與象牙海參的遺傳距離(0.213)外, 基本上不同屬之間的遺傳距離大于屬內的遺傳距離。海參科是海參綱內的第二大科, 約有185種, 其中海參屬又是數量最多的類群, 約有 150種[1], 因此, 在這一龐大類群內部的海參種類間的遺傳距離難免會出現較大的差異,而刺參科是相對較小的海參類群, 僅有 24種, 因此在分類上比較的簡單和清晰。

圖2 基于16S rRNA基因片段的刺參科骨片NJ進化樹Fig. 2 Ossicle phylogenetic tree of family Stichopodidae based on 16S rRNA genes

圖3 基于16S rRNA基因片段的海參科骨片NJ進化樹Fig. 3 Ossicle phylogenetic tree of family Holothuriidae based on 16S rRNA genes

3.2 基于 16S rRNA基因片段的海參分子系統(tǒng)發(fā)育

本研究中, 分子系統(tǒng)發(fā)育的結果與傳統(tǒng)的形態(tài)學分類結果一致, 較高的置信度表明, 刺參科和海參科是界限明晰的兩個類群。刺參屬、梅花參屬和棘輻肛參屬在系統(tǒng)樹上顯示出唯一的單態(tài)性, 說明三者是理想的分類階元。從進化樹可以看出, 刺參屬內花刺參與糙刺參的親緣關系較近, 兩者先聚為一簇, 然后與其他刺參屬海參聚在一起。蛇目白尼參與輻肛參屬的親緣關系較近, 兩者先聚為一簇, 然后與海參屬聚為一簇。仿刺參與梅花參屬的親緣關系較近, 兩者先聚為一簇, 再與刺參屬聚為一簇。

3.3 基于 16S rRNA基因片段的海參骨片進化關系

本研究基于海參線粒體 16S rRNA基因對刺參科和海參科內骨片的進化規(guī)律進行了推斷。結果表明, 在刺參科內, 刺參屬種類的體壁存在桌形體、C形體和花紋樣體; 仿刺參的體壁骨片主要是桌形體;梅花參屬種類的體壁只有桿狀體, 沒有桌形體、C形體和花紋樣體(圖 2)。骨片的進化關系顯示, 桌形體存在于刺參屬和仿刺參屬, 在梅花參屬內消失, 實際上, 仿刺參的桌形體在隨著個體的生長發(fā)育, 逐漸呈退化趨勢, 幼體仿刺參體壁的桌形體具有完整的塔部, 而在成年仿刺參體壁內, 桌形體的塔部已經退化[2]。因此, 仿刺參可以看做是桌形體在刺參科內退化的過渡階段。C形體和花紋樣體只存在于刺參屬內, 在仿刺參和梅花參屬內已經完全退化消失。在海參科內, 桌形體存在于海參屬種類, 白尼參屬和輻肛參屬內桌形體退化消失; 扣狀體只存在于部分海參屬種類(玉足海參、象牙海參和糙海參), 從黑海參直到輻肛參屬, 扣狀體退化; 海參屬內, 除了黑海參, 其他海參屬海參均不具有花紋樣體, 花紋樣體在白尼參屬和輻肛參屬中進化產生(圖 3)。Rowe認為海參骨片的進化過程是從古老的花紋樣體和桿狀體進化到桌形體和扣狀體, 而Levin等則認為桌形體和扣狀體比較原始, 隨后進化產生花紋樣體和桿狀體。本研究的結果表明, 在刺參科內, 桌形體逐步退化消失, 桿狀體隨之進化產生; 在海參科內, 桌形體和扣狀體慢慢退化, 隨后進化產生花紋樣體, 比較支持Levin的觀點。Kerr等[8]研究了海參科內8種海參的骨片系統(tǒng)發(fā)育, 表明海參科種類至少經過兩輪的從桌形體和扣狀體到花紋樣體的進化過程。本研究中海參科內花紋樣體的進化結果也顯示, 海參科內骨片的進化不是直接的, 與Kerr的觀點一致。

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Molecular phylogeny of 15 sea cucumbers and the inferences about the evolution of ossicles

WEN Jing1,2, HU Chao-qun2, FAN Si-gang2
(1．Department of Biology, Zhanjiang Normal University, Zhanjiang 524048, China; 2．LMB, LAMB, South China Sea Institute of Oceanology, the Chinese Academy of Sciences, Guangzhou 510301, China)

Nov., 22, 2010

sea cucumber; 16S rRNA gene; phylogeny; ossicle evolution

Molecular phylogeny of 15 recognized species of sea cucumbers were elucidated based on the partial sequences of the mitochondrial large ribosomal subunit (16S rRNA) gene. The results showed that the aligned sequences were 570 bp and the mean content of A+T was 54.7%. Their genetic distance ranged from 0．041 (betweenStichopus herrmanniandStichopus horrens) to 0．327 (betweenS. herrmanniandHolothuria edulis). The global branching pattern was coincident in neighbor-joining and maximum parsimony analyses, and both phylogenic trees supported the Linnean classification. Monophyly of family Stichopodidae, Holothuriidae, genusStichopus,ThelenotaandActinopygawere strongly supported by bootstrap analysis. Moreover, the phylogeny permited inferences about the evolution of ossicles within Stichopodidae and Holothuriidae. Our study indicates that tables and buttons are ancestral and later evolve into rods and rosettes.

Q178.53

A

1000-3096(2011)05-0066-07

2010-11-22;

2011-02-04

國家科技支撐計劃項目(2009BAB44B02); 廣東省海洋漁業(yè)科技項目(A200899E02, A200901E01); 廣東省科技計劃項目(2007A020300007-15); 廣東省省院合作計劃項目(2009B091300155);廣西自治區(qū)重點科技項目(桂科攻0815006-2)

文菁(1982-), 男, 湖南株洲人, 講師, 博士, 主要從事海參種質資源及水產養(yǎng)殖研究, 電話： 020-89023216, E-mail：jw82123@yahoo.com.cn; 胡超群, 通信作者, 博士生導師, 研究員,E-mail： cqhu@scsio.ac.cn

梁德海)