劉英杰，李瑩，潘艷艷，朱曉彤，劉軍，單風(fēng)平，曹雅明*

(1.中國醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室，遼寧沈陽110001;2.中國醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，遼寧沈陽110001)

瘧疾流行的顯著特征是反復(fù)感染普遍存在。目前全球流行的瘧疾主要由惡性瘧原蟲和間日瘧原蟲感染所致，其中前者毒力較強(qiáng)，并且再感染的發(fā)生風(fēng)險也明顯高于后者［1］。持久性免疫記憶的建立可抵御再感染的發(fā)生或可減少再感染后的蟲荷水平［2］。間日瘧感染者痊愈后，其免疫記憶水平可恒定保持?jǐn)?shù)月［3］，并可對間日瘧原蟲抗原產(chǎn)生明顯的應(yīng)答反應(yīng)，但惡性瘧感染者卻未能產(chǎn)生此應(yīng)答反應(yīng)［4］。這表明毒力不同蟲株感染與免疫記憶形成以及再感染的發(fā)生存在密切相關(guān)性。但惡性瘧和間日瘧感染早期根治性治療后，其免疫記憶形成是否存在差異目前尚未見明確報道。致死型約氏瘧原蟲(Plasmodium yoelii 17XL，P.y 17XL)和非致死型約氏瘧原蟲(Plasmodium yoelii 17XNL，P.y17XNL)分別與惡性瘧原蟲和間日瘧原蟲具有相似的生物學(xué)特性［5］。本研究對P.y17XL和P.y17XNL感染早期DBA/2小鼠進(jìn)行根治性治療，然后用同種瘧原蟲進(jìn)行再感染，通過對再感染前后脾細(xì)胞中記憶性T、B細(xì)胞百分率檢測，以期明確毒力不同蟲株感染早期根治性治療后的免疫記憶形成是否存在差異，并探討再感染能否進(jìn)一步促進(jìn)免疫記憶的產(chǎn)生。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料6～8周齡雌性DBA/2小鼠，購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究所;P.y17XL和P.y17XNL由日本愛媛大學(xué)分子寄生蟲學(xué)教研室惠贈。

1.1.2 主要試劑氯喹和青蒿琥脂片分別購自上海中西藥業(yè)有限公司和廣西桂林藥業(yè)有限公司;細(xì)胞熒光標(biāo)記抗體、HRP-羊抗鼠IgG、IgG1和IgG2a及底物均購自BD Pharmigen。

1.2 方法

1.2.1 小鼠感染和治療及再感染小鼠經(jīng)腹腔分別接種P.y17XL和P.y17XNL(1×106)寄生的紅細(xì)胞，尾靜脈采血，觀察紅細(xì)胞感染率。初次感染后3 d，開始經(jīng)口給藥(青蒿琥脂片60 mg/kg，氯喹90 mg/kg)，1次/d，連續(xù)3 d。初次感染后90 d，用同種瘧原蟲再次感染小鼠。

1.2.2 脾細(xì)胞中記憶性T、B細(xì)胞百分率的檢測

無菌取出再感染前(0 d)和再感染后第1、3、5天小鼠脾臟，制備脾細(xì)胞懸液，調(diào)脾細(xì)胞終濃度為1×107/mL。在預(yù)先加入封閉抗體的染色管中加入脾細(xì)胞懸液0.1 mL，然后在檢測記憶性T細(xì)胞染色管中依次加入FITC-conjugated anti-mouse CD4、APC-conjugated anti-mouse CD62L和PE-conjugated anti-mouse CD45RB;在檢測記憶性B細(xì)胞染色管中加入PerCP-conjugated anti-mouse B220和FITC-conjugated anti-mouse IgG，洗滌2次，流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.3 統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用SPSS 11.5統(tǒng)計學(xué)分析軟件，Student’s-t檢驗比較各組均值的顯著性差異，P＜0.05為差異顯著(結(jié)果為3次結(jié)果的均值)。

2 結(jié)果與分析

2.1 再感染后不同時間的原蟲血癥水平

如圖1所示，感染早期根治性治療的小鼠在再感染過程中僅出現(xiàn)了短暫的低水平蟲體血癥。在再感染后每一檢測時間點，不同毒力蟲株的蟲體血癥水平基本相似，并均于攻擊后第6天左右自愈;而未治療初次感染小鼠的蟲體血癥水平持續(xù)升高，表明毒力不同瘧原蟲初次感染早期根治性治療的小鼠對同種瘧原蟲的再感染具有相似的抵抗力。

圖1 P.y17XL和P.y17XNL初次感染和再感染后的蟲體血癥水平Fig.1 The levels of parasitemia after primary infectionand reinfection with P.y17XL and P.y17XNL

2.2 再感染前后不同時間點脾T細(xì)胞中記憶性T細(xì)胞的百分率

如圖2所示，在再感染前，2種毒力不同蟲株感染鼠脾T細(xì)胞中的記憶性T細(xì)胞百分率均略高于正常小鼠，與之相比，再感染后的記憶性T細(xì)胞百分率均明顯增加(*P＜0.05或＊＊P＜0.01);與相應(yīng)的再感染前小鼠相比，P.y17XL感染鼠的記憶性T細(xì)胞在再感染后第1天即出現(xiàn)了有意義的升高(☆P＜0.05)，而P.y17XNL感染鼠在再感染后第5天也出現(xiàn)了有意義的升高(☆P＜0.05)。這表明再感染前小鼠體內(nèi)存在少量的記憶性T細(xì)胞;再感染可促進(jìn)記憶性T細(xì)胞形成。但在每一相同檢測時間點，不同毒力蟲株感染鼠的記憶性T細(xì)胞水平基本相似。

圖2 再感染前后不同時間點脾T細(xì)胞中記憶性T細(xì)胞的百分率Fig.2 The percentage of memory T cell in spleen T cells from mice pre-and post-reinfection with P.y17XL and P.y17XNL at different time points

2.3 再感染前后不同時間點脾細(xì)胞中記憶性B細(xì)胞的百分率

圖3 再感染前后不同時間點脾細(xì)胞中記憶性B細(xì)胞的百分率Fig.3 The percentage of memory B cells in spleen cells from mice pre-and post-reinfection with P.y17XL and P.y17XNL at different time points

如圖3所示，再感染前小鼠脾細(xì)胞中記憶性B細(xì)胞的百分率略高于正常鼠;與正常鼠或再感染前小鼠相比，感染后第3、5天，2組小鼠記憶性B細(xì)胞百分率均明顯增加(＊＊P＜0.01;☆P＜0.05或☆☆P＜0.01);但在再感染后第5天出現(xiàn)不同程度的下降。在每一相同檢測時間點，不同毒力蟲株感染鼠的記憶性B細(xì)胞水平大致相同。表明再感染前小鼠體內(nèi)存在少量的記憶性B細(xì)胞;再感染可促進(jìn)記憶性B細(xì)胞的形成，但高水平記憶性B細(xì)胞不能持續(xù)存在。

3 討論

有研究顯示，間日瘧感染者痊愈后，其免疫記憶可持續(xù)存在，并可對間日瘧原蟲抗原產(chǎn)生明顯的應(yīng)答反應(yīng)，但惡性瘧感染者卻未能產(chǎn)生此應(yīng)答反應(yīng)［3-4］。提示毒力不同蟲株感染與免疫記憶形成以及再感染的發(fā)生存在密切相關(guān)性。瘧原蟲感染雖然可誘導(dǎo)記憶性T、B細(xì)胞產(chǎn)生［6-8］，但強(qiáng)毒株瘧原蟲感染可抑制免疫記憶形成［9］。

本研究顯示，在再感染過程中，2組小鼠均出現(xiàn)了短暫的低水平蟲體血癥。表明2組小鼠對同種瘧原蟲的再感染具有相似的抵抗力。再感染前，2組小鼠脾細(xì)胞中記憶性T、B細(xì)胞水平相似，均略高于正常小鼠，提示感染早期根治性治療小鼠可產(chǎn)生少量免疫記憶T、B細(xì)胞。有實驗證實，少量記憶性T、B細(xì)胞的存在，即使不能完全抵御再感染的發(fā)生，但也可明顯降低再感染的蟲荷水平［6-8］，與本研究結(jié)果基本吻合。此外，本研究還顯示，再感染可進(jìn)一步促進(jìn)記憶性T、B細(xì)胞產(chǎn)生，但無論是再感染前或再感染后，2組小鼠記憶性T、B細(xì)胞的水平在相同檢測時間點均沒有顯著差異?？梢姡?dāng)P.y17XL和P.y17XNL感染的紅細(xì)胞在外周血出現(xiàn)時即進(jìn)行根治性治療，可使小鼠受到相同蟲荷的抗原刺激，同時也阻止了P.y17XL對免疫記憶形成的抑制作用，因此2組小鼠獲得了相似的免疫記憶和抵御再感染的能力。

綜上所述，不同毒力瘧原蟲感染早期的根治性治療可使宿主產(chǎn)生水平相近的免疫記憶，再感染可促進(jìn)免疫記憶的形成，但再感染后第5天記憶性B細(xì)胞水平的明顯下降，是否可以解釋人類不能對瘧疾感染產(chǎn)生消除性免疫尚有待進(jìn)一步證實。

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