國(guó)宏莉 李江華 李 斌 度長(zhǎng)海 張 麗

藤梨根又稱(chēng)陽(yáng)桃根，為植物獼猴桃科藤梨(軟棗獼猴桃)Actinidia arguta(Sieb.teZucc.)Planch或獼猴Achinensis Planch的根。近年來(lái)，藤梨根的抗腫瘤作用引起了國(guó)內(nèi)外部分學(xué)者的關(guān)注，并在構(gòu)效分析研究的指導(dǎo)下獲得了許多腫瘤細(xì)胞毒活性明顯提高的衍生物[1～3]。因此，了解藤梨根抗腫瘤作用的機(jī)制對(duì)于評(píng)價(jià)藤梨根及其衍生物作為抗腫瘤藥物開(kāi)發(fā)的潛力和指導(dǎo)衍生物的合成具有重要意義。我們前期研究表明藤梨根能明顯抑制人食管癌Eca-109細(xì)胞的生長(zhǎng)，并能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[4]。但細(xì)胞凋亡的機(jī)制尚不清楚，這引起了我們極大的興趣。本研究中，我們將對(duì)藤梨根誘導(dǎo)人食管癌Eca-109細(xì)胞凋亡，凋亡與Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)及Caspase活化的關(guān)系進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株與細(xì)胞培養(yǎng)

人食管癌細(xì)胞Eca-109細(xì)胞株購(gòu)于上海市中科院細(xì)胞庫(kù)，細(xì)胞在含10％小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)，24 h換液1次。

1.2 試劑和儀器

RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)于武漢天源生物技術(shù)有限公司，為Gibco公司產(chǎn)品(貨號(hào)31800-022)；超級(jí)新生牛血清為杭州四季青生物工程有限公司產(chǎn)品(批號(hào)050126)；實(shí)驗(yàn)用1∶250胰酶購(gòu)于武漢天源生物技術(shù)有限公司，為Difco公司產(chǎn)品(批號(hào)020411)；四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)購(gòu)于武漢天源生物技術(shù)有限公司，為Duchefa分裝(貨號(hào)BS0880)；二甲亞砜(DMSO)購(gòu)于武漢天源生物技術(shù)有限公司，為Sigma公司產(chǎn)品。Bax、Bcl-2及Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9相關(guān)蛋白均購(gòu)于福州邁新生物技術(shù)有限公司。藤梨根正丁醇藥液(以下簡(jiǎn)稱(chēng)藤梨根)由湖北醫(yī)藥學(xué)院藥學(xué)部新藥研制中心提供(500 ml，1 g/ml，pH=3.8)，使用時(shí)用RPMI 1640培養(yǎng)基稀釋到1 μg/ml、10 μg/ml、100 μg/ml等藥物濃度。酶標(biāo)儀(美國(guó)Biotech公司Powerwave型)；CO2培養(yǎng)箱(德國(guó)Binder CB150型)；數(shù)碼相機(jī)(日本尼康coolpix 4500型)；Motic 6.0 1 000高清晰度彩色病理圖像分析系統(tǒng)(廈門(mén)麥克奧迪有限公司)。

1.3 MTT法

將貼壁細(xì)胞用0.25％的胰蛋白酶消化后計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為4×104個(gè)/ml，接種于96孔板，待24 h細(xì)胞貼壁后加入藤梨根正丁醇藥液。實(shí)驗(yàn)組分別加入終濃度為1 μg/ml、10 μg/ml、100 μg/ml等藥物濃度的藥液，對(duì)照組加入等體積溶劑的培養(yǎng)液，每組12復(fù)孔，分別于加藥后第1、2、3 d等時(shí)間后測(cè)定各孔的吸光度值(A值)。測(cè)定前每孔加5 mg/ml的MTT 20 μl，溫育4 h，棄上清液，加入二甲基亞砜(DMSO)150 μl/孔。同時(shí)振蕩至結(jié)晶完全溶解，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在490 nm波長(zhǎng)下測(cè)定A490值。用各組的平均A值計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。

生長(zhǎng)抑制率=對(duì)照組A490-實(shí)驗(yàn)組A490對(duì)照組A490×100％

1.4 免疫細(xì)胞化學(xué)SP法及圖像分析

將濃度為4×104個(gè)/ml的Eca-109細(xì)胞接種于經(jīng)多聚賴(lài)氨酸包被的清凈蓋玻片上，用RPMI 1640培養(yǎng)基于37℃、5％CO2條件下，在24孔板中培養(yǎng)24 h后取出蓋玻片，PBS沖洗3次。0.1％Triton-100破膜﹑4％多聚甲醛固定，經(jīng)H2O2阻斷﹑血清封閉后，滴加50 μl一抗，PBS代替一抗作好陰性對(duì)照，4℃冰箱過(guò)夜。滴加生物素標(biāo)記的二抗，PBS沖洗3次。滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素，DAB顯色。蘇木精復(fù)染，鹽酸分化，氨水返藍(lán)，中性樹(shù)膠封片。結(jié)果判斷：每張細(xì)胞爬片隨機(jī)選取5個(gè)不同部位，顯微鏡下拍照，用Motic 6.0高清晰度彩色病理圖像分析系統(tǒng)對(duì)陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行分析，測(cè)定陽(yáng)性細(xì)胞的灰度值或光密度值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 藤梨根對(duì)人食管癌Eca-109細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

藤梨根對(duì)人食管癌Eca-109細(xì)胞生長(zhǎng)的影響見(jiàn)圖1。結(jié)果顯示，當(dāng)用1 μg/ml的正丁醇提取物作用24 h，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率為18.5％；當(dāng)延長(zhǎng)至72 h時(shí)，抑制率上升至45.3％ ；而用100 μg/ml的藥物作用72 h時(shí)，可使85％以上的細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制。結(jié)果表明，藤梨根對(duì)人食管癌Eca-109細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用，隨著藥物濃度的升高和作用時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)。

圖1 藤梨根對(duì)人食管癌Eca-109細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用

2.2 藤梨根對(duì)人食管癌Eca-109細(xì)胞Bax及Bcl-2表達(dá)的影響

藤梨根對(duì)人食管癌Eca-109細(xì)胞Bax及Bcl-2表達(dá)的影響見(jiàn)圖2、3。結(jié)果顯示，藤梨根對(duì)腫瘤細(xì)胞作用24﹑48﹑72 h后分別與對(duì)照組比較，用藥組Bax蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)(P<0.01)，同時(shí)伴Bcl-2表達(dá)的改變；空白對(duì)照組細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)水平最高即平均灰度值最小，胞質(zhì)著色的細(xì)胞數(shù)最多且呈深棕色。用藥24 h后Bcl-2蛋白表達(dá)開(kāi)始減弱，48 h后其表達(dá)量與對(duì)照組比較，差異有顯著意義(P<0.05)，72 h后降低更為明顯(P<0.01)。

2.3 藤梨根對(duì)Eca-109細(xì)胞Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9表達(dá)的影響

藤梨根對(duì)Eca-109細(xì)胞Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9表達(dá)的影響見(jiàn)表1。結(jié)果顯示，用1 μg/ml藤梨根對(duì)腫瘤細(xì)胞作用24 h時(shí)，Caspase-8表達(dá)未見(jiàn)明顯改變，Caspase-3、Caspase-9表達(dá)稍增強(qiáng)；作用48﹑72 h后，用藥組Caspase-3、Caspase-9表達(dá)逐漸增強(qiáng)。100 μg/ml藤梨根作用72 h時(shí)，兩組Caspase-3、Caspase-9表達(dá)均明顯增強(qiáng)(P<0.01)。

圖2 藤梨根對(duì)人食管癌Eca-109細(xì)胞Bax蛋白表達(dá)的作用

圖3 藤梨根對(duì)人食管癌Eca-109細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)的作用

表1 藤梨根對(duì)人食管癌Eca-109細(xì)胞Caspase-8、Caspase-9及Caspase-12蛋白表達(dá)的作用(光密度,±s)

表1 藤梨根對(duì)人食管癌Eca-109細(xì)胞Caspase-8、Caspase-9及Caspase-12蛋白表達(dá)的作用(光密度,±s)

基因24h48h72hCaspase?8 1μg/ml0．100±0．0150．112±0．0110．121±0．014 10μg/ml0．114±0．0130．125±0．0160．126±0．011 100μg/ml0．115±0．0070．125±0．0170．138±0．020? 空白對(duì)照0．106±0．0130．116±0．0120．121±0．015Caspase?9 1μg/ml0．114±0．013?0．134±0．021?0．151±0．013? 10μg/ml0．145±0．015?0．172±0．016?0．197±0．009? 100μg/ml0．167±0．010?0．201±0．012?0．228±0．017? 空白對(duì)照0．100±0．0110．112±0．0130．120±0．016Caspase?3 1μg/ml0．104±0．0090．125±0．011?0．146±0．015? 10μg/ml0．111±0．0130．135±0．020?0．187±0．020? 100μg/ml0．115±0．0170．152±0．017?0．217±0．014? 空白對(duì)照0．105±0．0100．115±0．0210．122±0．018

與對(duì)照組比較*為P<0.05；**為P<0.01

3 討論

細(xì)胞凋亡是由基因編碼控制的1種細(xì)胞的程序性死亡，是機(jī)體維持正常生理活動(dòng)所必需的。近年發(fā)現(xiàn)，腫瘤的發(fā)生、發(fā)展不僅與細(xì)胞增殖有關(guān)，亦與細(xì)胞凋亡有關(guān)。凋亡基因精確調(diào)控凋亡過(guò)程。目前認(rèn)為至少有3條通路參與凋亡的發(fā)生即傳統(tǒng)信號(hào)傳導(dǎo)通路、死亡受體通路( death receptor pathway)和線粒體通路(mitochondrial pathway)通路，各條通路間又有串話(cross talking)，共同促進(jìn)細(xì)胞凋亡。3條凋亡通路最終都激活Caspase，但Caspase基因敲除實(shí)驗(yàn)表明細(xì)胞存在凋亡的代償通路[5，6]。

近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)Bcl-2家族及Caspase家族在介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的線粒體通路中起著非常重要的作用[7～9]。部分研究顯示藤梨根能增強(qiáng)肺組織促凋亡細(xì)胞因子如heme oxygenase-1、foxp3,TGF-β1等的表達(dá)，亦有報(bào)道顯示能下調(diào)BCL-2：BAX mRNA的轉(zhuǎn)錄率[10，11]。本研究表明，藤梨根不同藥物濃度1 μg/ml、10 μg/ml、100 μg/ml作用于Eca-109細(xì)胞24﹑48﹑72 h后，有明顯的凋亡特征。MTT法檢測(cè)到藤梨根能明顯抑制Eca-109細(xì)胞的生長(zhǎng)；免疫組化SP法檢測(cè)Bax及Bcl-2蛋白的表達(dá)，與對(duì)照組比較用藥組Bax蛋白表達(dá)增強(qiáng)，Bcl-2表達(dá)減弱；而同時(shí)伴有Caspase-3及Caspase-9蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)。因此，我們推測(cè)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡可能是藤梨根抗腫瘤作用的機(jī)制之一，它可能通過(guò)線粒體通路發(fā)揮作用。而研究中我們也觀察到Caspase-8的輕度增強(qiáng)，這說(shuō)明細(xì)胞凋亡并不完全是個(gè)線性通路，或者藤梨根同時(shí)啟動(dòng)了幾種途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

凋亡發(fā)生時(shí)BH - 3 only 亞族蛋白和Bax 亞族蛋白相互作用，促使Bax 亞族蛋白寡聚化，并進(jìn)入線粒體，促使線粒體釋放細(xì)胞色素c 和Smac/ DIABLO，細(xì)胞色素c 釋放出來(lái)后，和凋亡蛋白酶激活因子(apoptotic protease activating factor,Apaf-1)結(jié)合，使Apaf-1寡聚化，激活procaspase- 9、 Caspase-9 激活下游的procaspase -3 及其它的executioner Caspase，引起凋亡。而死亡受體途徑是通過(guò)激活FADD ，由死亡效應(yīng)域(death effector domain ,DED)與procaspas 8 的前導(dǎo)區(qū)的DED 結(jié)合，激活procaspase 8。隨后Caspase-8 又激活下游的procaspase3 及其他Caspase 家族的executioner Caspase，引起凋亡。

細(xì)胞凋亡中信號(hào)分子間相互影響，構(gòu)成了細(xì)胞凋亡的環(huán)形通路—死亡環(huán)[12]。在這個(gè)死亡環(huán)里，Caspase、Bcl-2 、細(xì)胞色素相互作用：細(xì)胞色素能激活procaspase ，而有活性的Caspase 也能刺激線粒體釋放細(xì)胞色素C。這樣，上游分子和下游分子的凋亡信號(hào)呈級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)。而B(niǎo)cl-2 既能在細(xì)胞色素上游，也能在其下游發(fā)揮作用。阻斷這種環(huán)形放大的級(jí)聯(lián)效應(yīng)，從而有效的抑制細(xì)胞凋亡。

本研究顯示，藤梨根誘導(dǎo)Eca-109細(xì)胞凋亡中線粒體介導(dǎo)的內(nèi)部凋亡通路中的上游關(guān)鍵酶Caspase-9和下游的效應(yīng)分子Caspase-3均被激活，而且Caspase-3的激活伴隨Casapase-9的活化，這不僅提供了藤梨根誘導(dǎo)Eca-109細(xì)胞凋亡作用的基礎(chǔ)資料，而且為食管癌的防治提供了新的線索。

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